ApoA5基因rs651821位点多态性与侗族人群代谢综合征的关系研究*

杭远欣，王海英，周太梅，肖玉波

(湖南医药学院公共卫生与检验医学院，湖南 怀化 418000)

代谢综合征(MS)是腹型肥胖、高血压、高血糖、高甘油三酯(TG)血症和(或)低高密度脂蛋白水平等因素聚集在同一个体上发生的一种代谢异常症候群，基因与环境因素均可导致该病的发生[1]。位于载脂蛋白A5(ApoA5)基因起始密码子上游3 bp的单核苷酸多态性(SNP)位点rs651821，被证实与血清TG水平升高有关，并可能导致湖南侗族人群对高血压的易感性增加[2]，而该位点基因多态性与MS的相关性研究较少见[3]。本研究探讨了ApoA5基因SNP位点rs651821与侗族人群MS发生风险之间的关系，对筛选MS易感人群、降低MS发生率有重要意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2018年6月在湖南省通道侗族自治县某卫生院就诊的160例MS患者作为MS组，同时选取145例健康体检者作为对照组。纳入标准：符合2007年《中国成人血脂异常防治指南》的诊断标准[4]，即男性腰围大于或等于85 cm，女性腰围大于或等于80 cm；收缩压/舒张压大于或等于140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)；空腹血糖(FPG)大于或等于6.10 mmol/L；TG≥1.7 mmol/L；男性高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L，女性HDL-C<1.03 mmol/L，其中3项及以上异常时诊断为MS。排除标准：长期使用类固醇激素等药物；合并结缔组织疾病、继发性高血压、慢性肝病；未签署知情同意书。本研究获得湖南医药学院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要仪器及试剂 主要仪器设备：SW-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)；TG16-Ⅱ型台式高速离心机(湖南平凡科技有限公司)；聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(美国ABI公司)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；U-3010紫外可见分光光度计(日本Hitachi公司)；微量电子天平(北京博远祥德科学仪器有限公司)；BS-460型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。主要试剂：DNA细胞裂解液、核糖核酸酶、蛋白酶K、苯酚、氯仿、乙酸铵、无水乙醇、75%乙醇、引物、PCR试剂盒、DNA标记物、限制性核酸内切酶、琼脂糖等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3方法 采用调查表对所有受试者进行性别、年龄、身高、体重、腰围、血压等一般资料的收集，其中血压、腰围的测量由同一名护士连续测量3次，并记录3次的平均值。清晨空腹采血，分装并于—80 ℃保存。采用全自动生化分析仪检测FPG、TG、总胆固醇(TC)、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

查询ApoA5基因rs651821位点序列，利用Primer5.0设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中上游引物为5′-GTT GAA GTC AGG GTC GGA GA-3′，下游引物为5′-GTA ACA GGA TTT CGG GCA GT-3′。采用酚-氯仿法提取外周血白细胞中基因组DNA。采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法检测基因多态性。PCR反应体系：DNA模板0.5 μL、10×Taq Buffer 1.5 μL、2.5 mM三磷酸脱氧核苷0.3 μL、上游引物和下游引物(50 pmoL/μL)各0.2 μL、Taq酶(5 U/μL)0.1 μL、Mg2+1.2 μL、ddH2O补至15 μL。PCR扩增循环参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，68.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共20循环；然后95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共20循环；最后72 ℃延伸6 min。RELP反应体系15 μL，包含PCR产物10 μL，10×Buffer R 1.5 μL，Acc36Ⅰ限制性核酸内切酶(10 U/μL)0.1 μL，ddH2O 3.4 μL，在37 ℃下消化过夜。酶切产物电泳：制作1%琼脂糖凝胶并加入溴化乙啶(0.5 μg/mL)，将8 μL酶切产物加入胶孔，以6 μL DNA标记物为参照物，电泳30 min(120 V)，在凝胶成像系统中观察结果。

2 结 果

2.12组临床及生化指标比较 MS组体重、体重指数、腰围、FPG、收缩压、舒张压、TC、TG、LDL-C水平高于对照组，而身高、HDL-C水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 2组临床及生化指标比较

2.2PCR-RFLP检测和测序情况 ApoA5基因rs651821位点经Acc36Ⅰ酶切后，根据片段长度的不同对基因型进行判断，共检测到3种基因型，具体如下：TT基因型(119、38 bp)，TC基因型(157、119、38 bp)，CC基因型(157 bp)。见图1。为保证准确性，通过直接测序进一步确定基因型，各基因型测序峰图(正向测序)与酶切产物电泳结果一致。见图2。因为38 bp的核苷酸序列分子量小，电泳后无法在凝胶上显示，但不影响基因型的判读。

M为500 bp DNA标记物。

图2 ApoA5基因rs651821位点基因型测序图

2.32组基因型和等位基因频率分布情况 经χ2检验，2组基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2=0.495，P>0.05)，说明样本具有代表性，可反映整体基因分布情况。2组基因型和等位基因频率分布情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组基因型和等位基因频率分布情况[n(%)]

2.4各基因型携带者临床及生化指标比较 3种基因型携带者体重指数、舒张压、HDL-C、LDL-C水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CC基因型携带者腰围、收缩压、TC、TG水平高于TC、TT基因型携带者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各基因型携带者临床及生化指标比较

2.5ApoA5基因rs651821多态性与MS易感性的关系 排除年龄、性别和体重指数的影响后，TC基因型携带者患MS的风险是TT型携带者的1.743倍(95%CI：0.843～3.604，P<0.05)，CC基因型携带者患MS的风险是TT型携带者的11.508倍(95%CI：3.296～40.185，P<0.05)。见表4。

表4 ApoA5基因rs651821位点基因多态性与MS易感性的关系

续表4 ApoA5基因rs651821位点基因多态性与MS易感性的关系

3 讨 论

近年来，MS发生率逐年升高，已成为威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。有研究显示，2016—2017年，20～70周岁普通居民MS发生率增长至19.58%，其中男性为26.97%，女性为16.18%[5]。有研究表明，MS患者罹患糖尿病、心血管疾病和癌症的风险均显著增加[6-7]。除了非遗传因素如吸烟、饮酒和饮食等以外，遗传因素与MS之间的关系逐渐成为研究热点。国内外大量研究揭示了MS与多个基因的SNP存在相关性，如MG53基因[8-9]、IGF2BP2基因[10-11]、MC4R基因[8,12]等。

ApoA5基因是2001年发现的血浆载脂蛋白家族新成员，位于人类染色体11q23区域，由4个外显子和3个内含子组成，毗邻ApoA1/ApoC3/ApoA4基因簇，编码一种参与调节血浆TG和HDL-C水平的载脂蛋白[13]。ApoA5基因至少含有23个SNP位点，其SNP位点对高血压、血脂、血糖及心血管疾病影响的研究较多见[14-15]。研究已证实，ApoA5基因-1131T>C位点基因多态性与高脂血症显著相关，且可增加MS发生率[16-18]。rs662799(-1131T>C)和rs2266788(1259T>C)多态性与人群血脂代谢密切相关，其中rs662799(-1131T>C)被证实在匈牙利、日本、中国北方汉族人群中与MS显著有关，是MS的独立危险因素[19-22]。

本研究结果显示，MS组CC基因型及C等位基因频率分布显著高于对照组(P<0.05)。提示C型基因突变可能导致个体MS易感性增高，但其分子机制有待进一步探讨和研究。同时，本研究单独分析了不同基因型与临床及生化指标之间的关系，结果显示，CC基因型与腰围、收缩压、TC、TG水平密切相关，易导致MS的发生。此外，logistic回归分析显示，TC基因型携带者患MS的风险是TT基因型携带者的1.743倍，CC基因型携带者患MS的风险是TT基因型携带者的11.508倍。提示通道侗族自治县侗族人群ApoA5基因rs651821位点的变异会增加MS的发生风险，其中CC基因型OR值较大，其原因可能是样本量少、数据不均匀。受样本量及试验方法的限制，本研究仅对侗族人群rs651821位点进行了研究，ApoA5基因的其他变异体与MS的关系尚需进一步研究。

综上所述，在通道侗族自治县侗族人群中，ApoA5基因rs651821位点多态性与MS密切相关，携带CC基因型人群发生MS的风险会升高。