长春市养殖废水中隐孢子虫的检测方法及污染分析

吕兆丰，陈世珩，郑添予，李百英，刘柏峰，刘伯军*

1.长春工业大学化学工程学院，吉林长春 130012；2.延边大学，吉林延吉 133400；3.农安县动物疫病预防控制中心，吉林长春 130200

中国畜牧养殖业快速发展，但高速发展下，畜牧养殖废水及粪便的排放污染已经不容忽视，2019年，全国COD 排放总量中畜牧养殖污水占到45%，畜牧养殖业污水COD 排放量占到农业源77%，并且畜牧养殖业污水中大量氨氮的排放，其总量占全国和农业源的比例也高达24%和77%。值得注意的是，种类繁多的病原微生物存在养殖废水中，例如粪大肠菌群、细菌总数、寄生虫虫卵等病原体等。根据世界卫生组织和联合国粮食及农业组织的相关数据，目前已有大约200 种人畜共患传染病，其污染程度严重的至少为90 种，这些共患病最主要的传播途径之一就是通过畜禽粪尿排泄物传播到附近水体中。

世界范围内重点防范的介水传播病原体之一的隐孢子虫，已被世界卫生组织将其列入重要腹泻病原体之一。在畜牧养殖地区发病率明显高于非畜牧养殖地区[1]。目前国际上常用的隐孢子虫检测标准方式是由美国国家环保总局(USEPA) 制定并发布的1 623 种方法，但方法存在成本高、回收率低且不稳定等缺陷[2]。另外, 这些方法的参数是根据饮用水的品质来设定的，当它适用于环境样品和养殖废水时，有一定的不确定性。因此，本研究建立“膜过滤-蔗糖密度梯度离心”法浓缩纯化及免疫荧光检测隐孢子虫的方法，对长春市周边5 个养殖场的废水中隐孢子虫污染状况进行调查，以期为隐孢子虫病的防治和介水传播风险评估提供科学依据。

1 实验材料

1.1 水样采集

在长春市肉牛养殖密集的郊区选择5 家中小规模养牛场进行取样调查。样品采集为养殖场集水池，液面10 ～15 cm 处液体，每个采样点共采集样品10 L，在10 个不同位置进行采集，每1 L 为一个样品，共计100 个水样。采好的水样，放置冷藏盒暂存，在5 h 内送往实验室，放于-4 ℃冰箱暂时冷藏，参考车逍宇[3]提出的污水细菌技术方法，2 ～3 d内完成对采集到水样的水质、细菌和粪大肠菌群等分析。

1.2 隐孢子虫卵囊的纯化

采集的水样经过滤处理，滤膜为1 µm 孔径，滤膜上隐孢子虫和其它杂质被截留，丙酮溶解滤膜在20 ℃、2 000 g条件下离心10 min，吸掉上层离心液，再添加40 mL 丙酮相同条件下再次离心，吸掉上层离心液，底层沉淀添加5 mL 乙醇，轻轻混匀，再缓慢加入少量去离子水40 mL，20 ℃、2 000 g 条件下离心10 min，离心完成后去掉上清液。5 mL 的PBS 与沉淀用涡旋振荡器振荡混匀2 min。分别配置1:1 蔗糖溶液和1:2 蔗糖溶液，取1:1 蔗糖溶液20 mL，浓缩后的沉淀液5 mL，20 mL 1:2 蔗糖溶液依次缓慢加入到50 mL 离心管中，3 500 r/min 离心上述50 mL 离心管15 min，离心完成后可观察到离心管中的液体出现分层，依次为水层、卵囊层、蔗糖溶液层和沉淀杂质，卵囊层移至离心管中，PBS进行稀释，稀释比例为1:4，3 500 r/min, 离心15 min，收集卵囊沉淀。

1.3 染色镜检

通过免疫荧光分析进一步检测隐孢子虫卵囊[4]，按试剂盒说明书进行荧光染色和DAPI 染色。染色过程如下：在井形玻片放置纯化后的样品，玻片干燥后，使用50 µL 甲醇干燥固定；井形玻片加入DAPI 50 µL，保持2 min，弃上层液体，用蒸馏水清洗，加入50 µL Easy StainTM 荧光抗体染色试剂，井形玻片避光湿盒室温培养30 min，弃上层液体，缓慢加入300 µL 冷冻的固定缓冲液，保持2 min 倾斜，弃上层液体，加入10 µL 封固剂后加盖玻片，荧光显微镜下观察。在400 倍FITC 模式下观察，发现边缘呈苹果绿色目标物后转换至DAPI模式，当FITC 与DAPI 染色特征均符合染色特征时，在1 000 倍油镜下进一步对目标物确认，并全井计数。

1.4 方法验证和质量控制

通过纯水加标试验，确定验证方法可行性。隐孢子虫标样100 个左右加入10 L 水中，进行富集、分离、染色和镜检，以上步骤按照实验水样处理步骤。依据《生活饮用水标准检验方法》的要求，阳性隐孢子虫回收率为10%～100%，空白对照不得检出隐孢子虫卵囊。

2 结果

2.1 长春郊区的规模养牛场废水水质调查

5 家养牛场中分别有3家干清粪场和2 家水冲粪场。常规水质指标浓度变化情况详见表1。目前干清粪工艺小规模养牛场清粪程度不高，污水的有机物浓度和SS 浓度均较高，废水常规指标采用干清粪方式的养殖场废水比水冲粪方式养殖场废水高3～5 倍。

表1 4 家养殖场常规指标浓度

2.2 隐孢子虫纯化镜检结果

在荧光显微镜蓝光激发下孢囊壁发出苹果绿色荧光，当苹果绿色目标物DAPI 染色特征呈现边缘绿色，内部浅蓝色时，DAPI 染色为阴性，当内部呈现深蓝色染色特征或者观察到1 ～4 个细胞核时，DAPI 染色为阳性。

2.3 质量控制

通过阳性质控和阴性对照检测，结果显示：隐孢子虫阳性质控的回收率为17.0%～24.5%之间，符合GB/T5750．12-2006 的基本要求，检测结果中空白对照组均为阴性。说明本实验检测隐孢子虫分析结果可信。

2.4 养殖废水中隐孢子虫检测结果

从5 个养殖场集水池中，96%的样本（48/50）检测到隐孢子虫活卵囊，平均密度为41.56 个/L卵囊（范围为1 ～44 个/L 卵囊）。先前的研究报告了养殖场集水池卵囊计数的类似结果[5]。

表2 养殖废水中细菌总数，粪大肠菌群数和隐孢子虫卵囊检出情况

3 讨论

本次调查的5 家中小规模养牛场均位于郊区附近，对其排水均未采取任何特殊处理措施。隐孢子虫作为人畜共患的介水传染病的病原体之一，在畜牧发达地区主要传播方式就是通过粪便污染水源得以传播，至今吉林省畜牧废水中隐孢子虫的感染状况未见报道。此次调查结果表明：养殖业及禽畜加工业废水中含有的致病性原虫卵囊数量较多，未进行针对性处理去除，地表水受到原虫污染，主要途径为致病性原虫随雨水径流进入水源，之后深度扩散有待进一步追踪污染源调查。此次检测建立的“膜过滤-蔗糖密度梯度离心”法浓缩纯化及免疫荧光检测隐孢子虫，隐孢子虫回收率为17.0%～24.5%之间，符合GB/T5750．12-2006 的基本要求，成本降低，能运用于实际检测中。吉林省是畜牧业发展重点地区，涝坝水（低洼地积水）处饮用水的水源很容易被污染[6]，对控制用水安全有重要意义。