不同尖孢镰刀菌对莲藕致病力差异与防治试剂筛选

高泽普，佟 静，王宝驹，卢彩鸽，王丽萍，王素娜，武占会*

（1.北京市农林科学院蔬菜研究所，北京 100097；2.农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 100097；3.河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056038；4.北京市农林科学院植物保护研究所，北京 100097)

尖孢镰刀菌可造成多种植物发生腐败病、枯萎病等严重病害，可通过侵染莲藕地下根部，逐渐蔓延至地下茎及全株，常造成莲藕根状茎变褐腐烂，同时地上部分的叶、花由于输导机能受阻而干枯卷曲，严重的甚至会造成莲藕植株死亡。目前，能有效防治莲藕腐败病的化学药剂种类较少且药剂施用剂量过多，对周围环境、微生物甚至人类造成危害。通过验证不同尖孢镰刀菌对莲藕的致病力情况，并有针对性地筛选出1种高效防治莲藕腐败病的化学药剂和施用剂量，以及筛选出1种绿色生物防治方法，以减少对环境的污染，这对莲藕腐败病的防治与优质高产具有重大意义。

已有研究发现，哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌都可以作为生防菌对尖孢镰刀菌有一定的拮抗作用。为明确生防菌防治莲藕腐败病的效果，试验先期选择在室内进行试验，以期为下一步进行大田应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试病原菌

选取从莲藕茎部分离的尖孢镰刀菌（F），莲藕根部分离的尖孢镰刀菌（F）与从甜瓜根腐病病株上分离的尖孢镰刀菌（F）为供试菌株。供试菌株均从发病部位分离并纯化培养获得。

1.1.2 供试莲藕

藕块：从藕田中采收新鲜嫩藕，洗净，用无菌水冲洗若干次，取中间段切成厚度为3 cm的藕块后供试。

藕叶：采取新鲜、健康无病、大小均匀的初展嫩叶后放入提前配置好的基础营养液中，其中基础营养液采用日本鸭儿芹营养液配方（四水硝酸钙236 mg/L，硝酸钾708 mg/L，磷酸二氢铵192 mg/L，七水硫酸镁246 mg/L）。

1.1.3 供试药剂与生物制剂

供试药剂3种：硫·酮多菌灵、波尔多液和酸性氧化电位液体敷料；供试生物制剂2种：哈茨木霉菌剂、枯草芽孢杆菌剂（表1）。

表1 供试试剂有效成分含量及其来源

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌致病力试验

藕块接种：将在马铃薯琼脂培养基上培养7 d的3种尖孢镰刀菌用7.0 mm无菌打孔器打孔，在菌落边缘切取菌丝块，将菌丝块接种在藕块中央位置，菌丝块的菌丝面朝下与藕片接触，每个藕片放置1个菌丝块，接种后放置在温度为（25±1） ℃，湿度≥90%的环境中保湿培养，每个处理重复12片。

藕叶接种：与藕块接种方式相同，将藕叶以叶长半径与叶短半径之间的连线为分界线，均匀分为4个等份，将菌丝块接种到每份中央距离叶边距5 cm处，每等份叶片上放置1块菌丝块，菌丝块上放置1团灭菌的棉球保湿，与接种藕块放入相同环境条件下培养。每个处理重复6片藕叶。

以在藕块、藕叶上接种灭菌的马铃薯琼脂块作为对照，第7天记录各处理发病率（发病率＝发病藕块或藕叶/总数×100%），并根据表2、表3腐败病分级标准调查病级数，计算病情指数（病情指数＝∑（各级病株数×该病级值）/（总数×最高等级）×100）。

表2 莲藕腐败病分级标准

表3 莲藕腐败病分级标准

1.2.2 药剂平板抑菌试验

病原菌培养：各供试病原菌经PDA培养基在（25±1）℃黑暗条件下倒置培养7 d后备用。药剂毒力：采用生长速率法进行测定，将供试化学药剂用无菌水调配成相应的浓度梯度（表4）。其中硫·酮多菌灵与波尔多液采用巴氏消毒法灭菌30 min，在超净工作台分别吸取2 mL药剂与18 mL经121 ℃灭菌20 min后的PDA培养基混匀冷却后备用；酸性氧化电位液体敷料采用表面喷施PDA培养基2 mL后在黑暗密闭的条件下备用，需现用现配。生物菌剂抑制率：采用对峙培养法进行测定，将生物菌剂活化后调配成相应浓度（表4），使用1 mL移液枪在距离平板边缘2 cm处滴1次，每个平板对称滴4个位置。

将供试平板准备好后，用直径7.0 mm的灭菌打孔器沿着病原菌培养基的菌落边缘切取菌丝块（菌饼），将菌丝块与培养基中央贴合，每个培养皿放1块菌饼。以灭菌培养基为空白对照，每个处理重复3次。经（25±1）℃恒温培养7 d后用十字交叉法测量各处理菌落直径平均值，并计算菌丝生长抑制率。抑制率＝（对照纯生长量－处理菌落纯生长量）/对照纯生长量×100%；纯生长量＝菌落平均直径－菌饼直径。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对尖孢镰刀菌的抑制效果

室内平板抑菌试验结果如表4所示，供试药剂中对莲藕腐败病的致病菌防治效果最好的为硫·酮多菌灵，在设计的浓度梯度范围内对3种供试菌株的菌丝生长均达到100.0%的抑菌率。波尔多液处于浓度≥1.0 g/L时，对F的防治效果可达61.0%以上，对F、F的抑菌率≤40%。低浓度的酸性氧化电位液体敷料对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果差，甚至没有效果，仅浓度最高即60 mg/L时，对F、F、F的抑菌率可至41.0%以上。2种生物菌剂也表现出了较好的抑菌效果，哈茨木霉菌剂在浓度为3.0 g/L时对F、F、F抑菌率达到最高值，分别为78.8%、86.7%、76.9%。枯草芽孢杆菌剂在浓度为3.0 g/L时，对F、F、F的抑菌率分别达到最高，即65.0%、60.0%、46.2%。

表4 不同药剂对尖孢镰刀菌的抑制效果

2.2 不同尖孢镰刀菌对莲藕的致病力差异

采用菌丝块接种的方式将3种尖孢镰刀菌接种莲藕，从接种的藕块与藕叶发病情况表明，不同的接种病原菌都可以导致离体莲藕发病，并且在实验室中进行接种的腐败病症状与自然环境下感染的腐败病症状相同。将接种的莲藕发病部位分离纯化得到的病原菌进行形态观察和回接验证均与原始菌株完全一致。

供试的藕块与藕叶发病情况如表5所示，F发病率与病情指数高于其他病原菌，藕块接种病原菌的发病率达100.0%。在实验室平板培养中，相同时间内F的纯生长量最高，说明其生长速率也最高。F对莲藕的致病力次于F。F的致病力最弱，病情指数也最低。虽然供试的3种病原菌同属于镰刀菌属，但F和F对莲藕致病性却表现出了显著差异，F和F表现差异不显著。

表5 各处理发病情况

3 结论与讨论

通过形态学与分子鉴定的手段发现造成莲藕发生腐败病的病原菌主要为，其与莲藕致病菌尖孢镰刀菌.是近缘关系，且通过病藕的ITS序列分析后发现.和.都可以使莲藕感染腐败病。致病力试验结果也证实以莲藕为供试材料的.的致病力和病情指数要高于.，而从甜瓜病株上分离出的尖孢镰刀菌侵染程度较低，在自然环境下可能并不会造成健康的莲藕植株感病。

在药剂平板抑菌试验中，硫·酮多菌灵对莲藕腐败病的抑菌率最高，在设置的浓度梯度下均可100.0%抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长，波尔多液在高浓度下（≥1.0 g/L）对才表现出较好的抑制率，可作为土壤或种藕的消毒剂使用，而酸性氧化电位液体敷料主要成分为次氯酸，常作为消毒剂使用，对环境污染较小，但对3种镰刀菌的防治效果较差，因此不建议作为防治药剂使用。生防菌防治试验表明，哈茨木霉菌剂（3.0 g/L）对的防治效果最高可达78.8%，枯草芽孢杆菌剂在3.0 g/L用量下对的防治效果达65.0%，这2种生防菌剂对尖孢镰刀菌都起到了很好的抑制效果。由于这2种菌的拮抗机制不同，哈茨木霉菌通过重寄生机制，枯草芽孢杆菌是通过拮抗机制进行防治。下一步可以试验将2种生防菌联合防治莲藕腐败病，其效果有可能优于单一生防菌剂。

由于本研究筛选出的药剂和生物制剂仅在实验室条件下进行，筛选生防菌的种类只有1种生防真菌和1种生防细菌，从实际栽培的角度出发，复杂的自然环境条件下或许存在更多的生防菌对莲藕腐败病病原菌有拮抗作用；因此，还应从莲藕根际土壤中取样，筛选更多对镰刀菌有拮抗作用的生防菌，并进行综合分析。若要将防治试剂大面积推广给农户施用，还需要进一步进行模拟藕田的真实种植环境试验，以提供更加科学、规范的莲藕腐败病防治方法。