高效液相色谱-质谱法同时测定复合维生素B 片中5 种成分含量

2022-05-16陈乃江

中国药业 2022年9期

李姮，李玲，吴琦，陈乃江

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏连云港 222006）

复合维生素B 片主要含有维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙，用于预防和治疗B 族维生素缺乏所致营养不良、厌食、脚气病、糙皮病等。截至2021年5月，我国共有复合维生素B 片批准文号103个。其标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·化学药品及制剂（第一册）》［WS1-73（B）-89］，分别采用重量法、紫外分光光度法和凯氏定氮法测定维生素B1、维生素B2和烟酰胺的含量，但存在操作复杂、步骤烦琐、专属性差等问题［1］。曾采用高效液相色谱- 紫外光谱（HPLC - UV）法、高效液相色谱- 二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法［2-7］、核磁共振法［8］、毛细管电泳法［9］测定复合维生素B片中的成分，但部分成分在C18柱中保留较差，部分成分紫外吸收较弱，很难使复合维生素B片中5 种成分达到良好分离。QDa 是一种操作简单、维护方便的小型质谱检测器，被广泛应用于化学成分［10-14］和农药残留［15］的快速测定。本研究中应用此检测器，采用高效液相色谱- 质谱（HPLC - MS）法同时测定复合维生素B 片中5 种成分的含量，为提高其质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Alliance e2695 型高效液相色谱仪、Waters Acquity QDa 型质谱仪（美国Waters 公司）；Sartorius BP211D型分析天平（德国Sartorius公司，精度为0.01 mg）；KH -700DE 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为700 W，频率为40 kHz）；Milli - Q 型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

复合维生素B 片（天津力生制药股份有限公司，批号分别为1804010 和1905019；南京白敬宇制药有限责任公司，批号为190751；规格均为每片分别含维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙3.0，1.5，0.2，10.0，1.0 mg）；维生素B1标准品（批号为100390 -201806，含量为97.9%），维生素B2标准品（批号为100396-201905，含量为98.2%），维生素B6标准品（批号为100116 - 201906，含量为99.9%），烟酰胺标准品（批号为100115-202005，含量为99.9%），泛酸钙标准品（批号为100370-201903，含量为96.8%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

1）色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈- 0.1%甲酸溶液（50∶50，V/V）；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2）质谱条件

离子源：电喷雾离子（ESI）；离子化模式：正离子模式；单离子记录（SIR）模式下扫描；锥孔电压：15 V；毛细管电压：0.8 kV；探头温度：600 ℃；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙的质荷比（m/z）分别为265，377，170，123，220，均为定量离子。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取维生素B1、维生素B6和泛酸钙对照品各适量，精密称定，加0.1%甲酸溶液制成质量浓度为400 μg/mL 的对照品贮备液Ⅰ；取烟酰胺对照品适量，精密称定，加0.1%甲酸溶液制成质量浓度为200 μg/mL 的对照品贮备液Ⅱ；取维生素B2对照品适量，精密称定，加5%氨水溶液制成质量浓度为600 μg/mL的对照品贮备液Ⅲ。分别精密量对照品贮备液Ⅰ、对照品贮备液Ⅱ、对照品贮备液Ⅲ各适量，置100 mL 容量瓶中，制成每1 mL 含维生素B120.94 μg、维生素B259.80 μg、维生素B68.78 μg、烟酰胺9.85 μg、泛酸钙41.84 μg的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品20片，精密称定，研细，取粉末适量（约相当于维生素B13 mg），精密称定，置100 mL容量瓶中，加0.1%甲酸溶液适量，超声（功率为700 W，频率为40 kHz）10 min，放冷，称定质量，用0.1%甲酸溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：吸取2.2项下混合对照品溶液适量，倍比稀释成系列质量浓度的溶液，按2.1项下试验条件进样测定，剔除超限浓度，以溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、各组分定量离子的峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液（维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙的质量浓度分别为0.6544，1.8688，0.2744，0.3078，1.3075 μg/mL）适量，按2.1 项下试验条件连续进样测定6 次，记录各组分定量离子的峰面积。结果维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙成分定量离子峰面积的RSD分别为1.89%，2.83%，3.46%，3.14%，2.68%（n= 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为1804010）样品适量，精密称定，依法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1项下试验条件进样测定。结果维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙含量的RSD分别为2.01%，2.53%，3.11%，3.25%，2.74%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为1804010）样品适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按2.1 项下试验条件进样测定。结果维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙定量离子峰面积的RSD分别为2.15%，3.09%，2.86%，3.22%，3.31%（n= 6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为1804010）粉末适量，精密称定，共6份，分别精密加入混合对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下试验条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取3 批（批号分别为1804010，190751，1905019）样品，各3 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下试验条件进样测定，按外标法计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 溶剂选择

在制备对照品溶液的过程中发现，维生素B1、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙能完全溶解于0.1%甲酸溶液，但维生素B2不能，将维生素B2的溶剂改为5%氨水溶液后能完全溶解。故制备对照品溶液时选择不同溶剂。

3.2 检测器选择

复合维生素B 片中的5 种成分极性较大，在C18柱上的保留和分离度均较差，泛酸钙的紫外最大吸收波长小于200 nm，接近甲醇和乙腈等有机溶剂的截止波长，受流动相干扰较大，故不宜采用HPLC-UV 法同时测定5 个成分。本研究中采用HPLC -MS 法测定，配备QDa 小型质谱检测器进行试验，其价格低廉，维护保养成本低，操作简便，较HPLC - UV 法或HPLC - DAD 法具有灵敏度高、专属性强、检测时间短等优点。

3.3 质谱条件选择

比较了正、负2 种离子模式，发现正离子模式下待测物较易电离；考察每个化合物的锥孔电压（9，11，13，15，18，21 V），结果锥孔电压为15 V 时待测物的色谱峰峰形较好，灵敏度较高；当流速为0.6 mL/min 时，考察不同毛细管电压（0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 kV），结果毛细管电压为0.8 kV 时色谱峰峰形较好，灵敏度较高。故最终确定MS 条件为正离子模式，锥孔电压15 V，毛细管电压0.8 kV。