高效液相色谱法测定绿豆糕中的脱氢乙酸

◎ 王岁岁

（马鞍山市产品质量监督检验所，安徽 马鞍山 243000）

脱氢乙酸（Dehydroacetic Acid，DA），别名二乙酰基乙酰乙酸，性状为无色至白色针状或板状结晶或白色结晶粉末，无臭，略带酸味，不易溶于水，易溶于碱性溶液。脱氢乙酸饱和水溶液pH=4。脱氢乙酸具有很好的防腐、防霉效果[1-3]，其中对霉菌和酵母的抑菌能力最强[4]。脱氢乙酸常作为防腐剂被用于腐乳、 酱菜、糕点等食品中。食入的脱氢乙酸达到一定的剂量后，对人体具有潜在危害[5]。因此，准确检测食品中的脱氢乙酸含量对把控脱氢乙酸的摄入量具有重要意义。

目前国标中检测食品中脱氢乙酸的方法主要有气相色谱法[6-7]和液相色谱法[8-11]。其中，液相色谱法前处理烦琐而低效，重现性不好，且易出现峰拖尾、分叉等现象，不利于脱氢乙酸的定性及定量。脱氢乙酸电离常数较低，不同的酸碱条件可能影响脱氢乙酸的出峰效果[12]。因此，本研究以绿豆糕为样品，基于高效液相色谱法，建立简单易操作的脱氢乙酸检测方法，并考察流动相的pH值升高对脱氢乙酸峰形的改善作用，为今后快速有效检测食品中的脱氢乙酸提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品：绿豆糕，市场购买。

脱氢乙酸标准品：TMstandard，批号21060503；沉淀剂1：亚铁氰化钾溶液，称取106 g亚铁氰化钾，用水溶解并定容到1 000 mL；沉淀剂2：乙酸锌溶液，称取220 g乙酸锌用少量水溶解，加入30 mL冰乙酸，用水定容到1 000 mL；氢氧化钠溶液（20 g·L-1）：称取20 g氢氧化钠溶于水中，并定容到1 000 mL；甲醇：色谱纯；乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）：称取1.54 g乙酸铵，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）：日本岛津科学仪器公司；AL204电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；CQ-300B-S超声波清洗机：上海跃进医用光学器械厂；ST5000/F pH计：奥豪斯仪器（常州）有限公司；HC-3018R冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；针式滤膜：水相滤膜，0.22 μm；Angilent HC-C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.3 方法

1.3.1 实验基本条件

本实验选用Angilent HC-C18色谱柱（pH耐受范围为2～9）；流动相为甲醇∶乙酸铵（0.02 mol·L-1）=7 ∶ 93；流速为 1.0 mL·min-1，进样量为 10 μL。

1.3.2 标准曲线的建立

准确称取0.250 0 g脱氢乙酸标准品。用5 mL氢氧化钠溶液（20 g·L-1）溶解后，用水定容至25 mL，即为1 000 μg·mL-1的标准储备液。将标准储备液用水 逐 步 稀 释 至 1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1和 100 μg·mL-1的标准系列浓度。

1.3.3 样品前处理

称取绿豆糕约2 g置于50 mL离心管中，加水30 mL，混匀后分别加入3 mL沉淀剂1和3 mL沉淀剂2，混匀，用20 g·L-1的氢氧化钠溶液调节样液酸碱值，用pH试纸测试，调至pH=7～8；超声提取20 min后，4 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中，用水定容，取适量过0.22 μm的滤膜，待上机。

1.3.4 流动相pH值的调节

用氢氧化钠溶液调节乙酸铵溶液的pH值，用pH计测定。分别调节至pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5和pH=9.0共4个梯度。

1.3.5 加标回收实验

以绿豆糕为本底，添加3个不同浓度的脱氢乙酸标准溶液，检测其脱氢乙酸值，每个浓度做5个平行，计算平均回收率及相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

利用二极管阵列检测器进行全波长扫描，结果发现脱氢乙酸的最大吸收波长为293 nm。

2.2 流动相pH值对脱氢乙酸峰形的影响

由图1可知，未调节乙酸铵溶液pH值前，脱氢乙酸峰拖尾、不对称，影响脱氢乙酸的定性和定量。将乙酸铵溶液pH值调至7.5时，脱氢乙酸峰依旧拖尾严重，如图2。继续调高乙酸铵溶液pH值至8.0，如图3所示，脱氢乙酸峰仍旧有拖尾现象，但相比于图1和图2，峰拖尾现象有所减缓。调节乙酸铵溶液pH值至8.5，脱氢乙酸出峰效果如图4所示，此时脱氢乙酸峰形良好，峰尖锐且对称，无拖尾现象。当乙酸铵溶液pH值调至9.0时，结果如图5所示，脱氢乙酸峰形良好，无拖尾现象，与图4相比无显著差别。由上说明，乙酸铵溶液的pH值高低对调节脱氢乙酸的峰形有一定的作用，在一定范围内，pH值越高，峰形越好，拖尾现象越不明显。当pH值达到8.5时，峰形达到最优，继续升高乙酸铵溶液pH值，峰形无显著变化，结合色谱柱的酸碱耐受性（pH<9），因此选择乙酸铵溶液pH=8.5为最佳实验条件。

图1 脱氢乙酸20 μg·mL-1色谱图（未调节pH值）

图2 脱氢乙酸20 μg·mL-1色谱图（pH=7.5）

图3 脱氢乙酸20 μg·mL-1色谱图（pH=8.0）

图4 脱氢乙酸10 μg·mL-1色谱图（pH=8.5）

图5 脱氢乙酸 20 μg·mL-1色谱图（pH=9.0）

2.3 脱氢乙酸标准曲线

将脱氢乙酸标准系列浓度在上述实验条件下上机进样，得到标准曲线如图6所示。由图6可知，在1～100 μg·mL-1浓度范围内，脱氢乙酸响应值与浓度之间呈现良好的线性关系，回归方程为y=31 923x，其线性相关性系数R2=0.999 9。

图6 脱氢乙酸标准曲线图

2.4 方法回收率及相对标准偏差确定

将处理好的绿豆糕样品溶液在上述实验条件下测定，根据脱氢乙酸标准曲线定量，计算得绿豆糕中脱氢乙酸的含量为 0.260 g·kg-1。分别添加 0.10 g·kg-1、0.20 g·kg-1、0.30 g·kg-1浓度的脱氢乙酸标准品于绿豆糕中，测定其回收率，结果如表1所示。

由表1可知，在本实验条件下绿豆糕的加标回收率为95%～100%，相对标准偏差为1.2%～1.7%。说明此方法结果值可信，具有一定的可操作性。

表1 绿豆糕加标回收率测定表

3 结论

本实验探讨了简便且适用的检测绿豆糕中脱氢乙酸的方法。实验结果表明，脱氢乙酸在293 nm处得到最大吸收峰。流动相设为甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸铵=7∶93，能很好地将脱氢乙酸与糖精钠等干扰峰分离。增大乙酸铵溶液的pH值，脱氢乙酸的峰形逐渐被改善，拖尾现象得到缓解，说明乙酸铵溶液的酸碱度在一定范围内对调节脱氢乙酸的出峰效果起到了很大作用。将乙酸铵溶液pH值调至8.5，脱氢乙酸峰形尖锐且对称，能达到最优的出峰效果，解决了以前脱氢乙酸峰拖尾及出现鬼峰等现象。对绿豆糕进行加标回收实验，得到回收率为95%～100%，说明此方法具有一定可操作性。

综上所述，本实验中基于高效液相色谱法检测绿豆糕中脱氢乙酸的方法，具有简单易操作、快速、出峰效果好、结果值可信以及重复性好等特点，适用于检测食品中的脱氢乙酸含量。