慢性乙型肝炎患者血清HBV恩替卡韦耐药基因突变模式调查*

王广丽，徐 欢，董丹丹，黄 荷

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是因乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持续感染而致的肝脏慢性疾病，恩替卡韦等抗病毒药物是治疗CHB的主要药物。因抗病毒药物发展迅速、用药方案的多元化增加，HBV耐药突变株出现的概率也大大增加[1]。HBV在自然选择、宿主免疫力等多重因素作用下易产生耐药突变，进而影响抗病毒的治疗效果，导致病情反复，使疾病的治疗变得困难[2]。HBV复制需要逆转录过程，因其逆转录酶缺乏纠错能力，容易发生病毒基因变异，产生变异株的几率远高于其他DNA病毒，而HBV基因组各读码框架间为编码基因共用，增加了变异株发生的机会[3]。相关研究也指出，耐药变异株的出现严重影响了CHB患者的治疗效果[4,5]，故研究HBV耐药基因型分布特征及耐药突变模式，对于减少耐药事件的发生，提高临床治疗疗效至关重要，但目前对于HBV恩替卡韦耐药基因的研究尚处于探索阶段。本研究旨在探究HBV恩替卡韦耐药基因突变模式和新型rtL180M/A186T/M204V突变株表型的发生规律，以为更精准地治疗CHB患者提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年10月～2020年10月我院收治的CHB患者107例，男64例，女43例；年龄为31～58岁，平均年龄为(45.3±4.7)岁。CHB诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的标准[6]。纳入患者为拉米夫定、恩替卡韦或阿德福韦联合恩替卡韦经治患者，排除标准：(1)恶性肿瘤；(2)合并丙型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒感染者；(3)存在酒精性肝病或自身免疫性肝病。本研究获得我院医学伦理委员会审核，患者签署入组知情同意书。典型病例治疗情况：患者女性，47岁，于2009年7月被诊断为CHB，先后接受拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦联合恩替卡韦或替诺福韦治疗。在接受抗病毒治疗前，病毒准种池克隆显示为100%野生株(WT)，经拉米夫定治疗23个月时血清HBV DNA由2.0 lg IU/ml突破至6.94 lg IU/ml，病毒准种池显示为95% rtS202G突变和5% rtT184突变，随后换用恩替卡韦或阿德福韦联合恩替卡韦治疗，发现5% rtT184突变逐渐转变为90%优势病毒株，同时还检测出10%rtS202G/M204V/L180M突变，最后更换为替诺福韦治疗4个月后检测，发现血清HBV DNA低于检测下限。

1.2 HBV RT区基因突变分析 使用病毒DNA OUT试剂(北京天恩泽公司)提取血清HBV DNA，应用巢氏PCR法进行HBV RT基因扩增，PCR反应条件为94℃ 180 s、94℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 60 s，扩增35个循环，72℃延伸120 s。取PCR产物10 μL进行电泳鉴定，并对PCR产物进行DNA双向测序，分析rt184、rt202和rt250等经典恩替卡韦和拉米夫定耐药相关位点及rt180位点突变情况，应用MEGA4软件分析鉴定基因型。

1.3 重组质粒的构建与鉴定 使用质粒小量提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，选择受试者HBV RT野生株和rtS202G/M204V/L180M突变株菌液小量抽提质粒。应用核酸内切酶(美国Promega公司)，经双酶切后将RT区片段连接至pTriEx-HBV1.1倍载体上，转化至感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，接种于含100 μg/ml氨苄西林的LB培养板，37℃培养箱过夜，行克隆测序，制备转染级质粒备用。

1.4 细胞转染与病毒复制力分析 使用Plasmid Mini Kit试剂盒(德国QIAGEN公司)，采用脂质体转染HepG2细胞，每孔加入0.25 μg质粒，转染4 h，更换DMEM，并向培养液中加入0.0、0.001、0.01、0.1、1.0和10.0 μmol/L恩替卡韦或拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦，每2天更换为含有相应药物浓度的新培养液，连续培养4 d，收集细胞上清液，采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA载量，以无药物压力培养细胞上清HBV DNA水平代表病毒复制力水平。

2 结果

2.1 恩替卡韦耐药基因检出情况 在本组107例CHB患者中，恩替卡韦耐药基因rtS202G/M204V/L180M检出率显著高于其他耐药基因型(P<0.05，表1)。

表1 恩替卡韦耐药基因检出率(%)情况

2.2 恩替卡韦耐药患者核苷(酸)类药物抗病毒治疗史情况 恩替卡韦耐药患者应用过拉米夫定治疗者显著高于阿德福韦治疗者(P<0.05，表2)。

2.3 不同恩替卡韦耐药基因患者血清HBV DNA水平比较 基因型为rtS202sub和rtM250sub患者血清HBV DNA水平显著低于其他两型(P<0.05，表3)。

表2 恩替卡韦耐药患者核苷(酸)类药物抗病毒治疗史(%)情况

表3 不同恩替卡韦耐药基因患者血清HBV DNA水平比较

2.4 不同病毒株转染细胞培养上清HBV DNA载量比较 rtS202G/M204V/L180M突变株恩替卡韦培养上清HBV DNA水平显著高于rtT184A/M204V/L180M突变株(P<0.05)，而两种病毒株经替诺福韦作用培养上清HBV DNA水平无显著性差异(P>0.05，表4)。

表4 不同病毒株转染细胞培养上清HBV DNA载量比较

3 讨论

临床上，采用核苷(酸)类药物治疗CHB患者可通过抑制病毒复制起到改善肝功能的作用，但基因型耐药的出现可直接影响治疗效果，导致临床治疗的失败[7,8]。HBV是部分双链DNA病毒，其复制是由多聚酶通过RNA中间体完成的。由于缺乏校读功能，在长期使用核苷(酸)类似物治疗过程中会导致耐药株的出现[9,10]。恩替卡韦因具有较强的抗病毒效力，且能抑制肝组织学病变。恩替卡韦治疗时主要抑制的是病毒逆转录过程，而不能抑制细胞核中已形成的HBV cccDNA[11,12]。既往研究发现，恩替卡韦初治患者中长期治疗的耐药发生率较低，而对拉米夫定耐药患者使用恩替卡韦治疗后，其耐药发生率显著增加[13,14]，可能与拉米夫定具有交叉耐药性有关。相关研究也发现，恩替卡韦对于拉米夫定耐药突变株有明显的选择压力，患者在接受拉米夫定治疗失败后，再予以恩替卡韦治疗，出现耐药株的概率大大增加[15]。本研究对患者抗病毒治疗史进行分析，发现恩替卡韦耐药患者曾应用拉米夫定治疗者较多，提示经拉米夫定治疗后患者对恩替卡韦耐药率也会增加，可能是因为拉米夫定耐药患者病毒DNA聚合酶或逆转录区出现突变，会使病毒复制力增加，再给予恩替卡韦治疗时，可能会出现病毒学突破，进而增加恩替卡韦耐药的危险性。

不同HBV基因型的致病性和对核苷(酸)类药物治疗的反应差别较大。通过分析患者耐药基因可有助于改进后续治疗方法，进而可起到提高临床治疗效果、改善预后的作用[16]。本研究结果显示，在恩替卡韦耐药基因中，rtS202G/M204V/L180M检出率显著高于其他基因型，说明rtS202G/M204V/L180M为恩替卡韦的主要耐药基因。病毒发生变异与病毒复制水平有关，核苷类似物可抑制病毒复制，而无法起到清除病毒的作用。如药物能完全抑制病毒复制，其对病毒施加了更明显的选择压力，其产生耐药的概率就会降低[17,18]。本研究结果显示，基因型为rtS202sub患者血清HBV DNA水平显著低于rtT184sub、rtM250sub、rtT184/S202sub感染者，说明不同突变株对药物的敏感性不同。

抗病毒药物治疗CHB患者可有效抑制病毒复制，减轻肝脏炎症活动，延缓疾病进展，但HBV独特的复制机制使得患者在接受长期持久的抗病毒治疗后，大大增加了耐药突变株产生的风险[19,20]。对核苷(酸)类耐药患者中HBV逆转录酶耐药模式较多，耐药患者出现了病毒学反跳或治疗效果不理想[21]，提示除了已发现的耐药基因型外，可能还存在某些新的变异位点。M204V为拉米夫定耐药的主要突变位点，其可大大降低病毒对拉米夫定的敏感性，而恩替卡韦的耐药突变可建立在拉米夫定耐药变异之上[22]。本研究对rtM204V阳性患者进行直接测序，结果显示患者均存在rtA186T/L180M突变，提示rtS202G/M204V/L180M或可同时出现。病毒的适应力是指病毒在特定环境中的复制能力，即突变病毒株在无药物存在下相对于野生株的复制能力。本研究发现，rtS202G/M204V/L180M 突变株的复制力较强，可能与该变异株进入病毒生命周期中独特的cccDNA池有关。本研究结果显示，不同病毒突变株均对替诺福韦敏感，为耐药患者的挽救治疗提供了一种选择。