火烈鸟腹泻沙门菌分离鉴定、致病性及耐药性检测

邓丽玲 汪明权 李雨芮

(武汉动物园，武汉，430000)

火烈鸟(Phoenicopterusruber)是鹳形目(Ciconiiformes)红鹳科(Phoenicopteridae)的一种大型水鸟，亦称红鹳，主要分布于非洲、中南美洲和印度等部分亚热带地区的温热带盐水湖泊、沼泽及礁湖的浅水地带，主要靠滤食藻类、小虾、蛤蜊和昆虫等生物为生，性怯懦，喜群栖，极具观赏性，常在动物园被人工养殖与繁育[1-3]。

沙门菌(Salmonella)具有广泛的宿主性，可以感染多种动物和人，主要引起不同宿主的败血症、腹泻、肠炎及流产等，感染率和死亡率均较高，是临床中重要的人畜共患病原菌[1-3]。沙门菌血清型繁多，引起动物和人发病的沙门菌血清型目前有2 523个，是重要的食源性病原菌，该菌可以通过运输的动物和未煮熟的动物食品传播，对人的危害也较大，成为公共卫生研究的热点问题[4-5]。目前，服用抗生素是控制沙门菌感染的主要手段之一，抗生素的滥用造成了沙门菌的耐药现象日趋严重，沙门菌在抗生素的压力选择下产生严重的耐药性及交叉耐药性，成为多重耐药菌菌株，给临床中沙门菌的防控带来一定的困难，造成药物残留，危害生物的身体健康[6-8]。因此，对沙门菌的合理防控具有重要意义。国内关于兽类、禽类的沙门菌研究较多，但致火烈鸟腹泻的沙门菌未见报道。

本研究对动物园中患腹泻火烈鸟的102份粪便、肛拭子和死亡个体的肝脏等病料组织进行沙门菌分离鉴定，对其致病性及耐药性进行检测，以期为动物园中火烈鸟沙门菌的防控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2016—2020年，采集动物园中患腹泻火烈鸟的粪便、肛拭子和死亡火烈鸟的肝脏等病料组织102份。

1.1.2 试验动物

20 g左右的昆明系小白鼠450只，购自北京维通利华实验动物中心，由武汉动物园饲养。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与鉴定

将火烈鸟的病料组织样品处理后，接种于沙门菌增菌液(TTB)中，37 ℃震荡培养8～12 h，取培养的菌液接种于鉴定培养基(沙门菌显色培养基)中进行鉴别培养，在恒温培养箱中37 ℃培养12～18 h，挑单菌落纯化培养，进一步观察形态，进行生化特性鉴定。

1.2.2 细菌PCR鉴定

参考胡建乐[9]、吴晓君等[10]的方法，根据GenBank中沙门菌基因序列设计沙门菌鉴定引物invA，F：5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′，R：5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′，引物片段大小为241 bp，沙门菌的鉴定引物由深圳华大基因股份有限公司合成。分离得到的菌株采用水煮法提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，用鉴定引物进行PCR鉴定。将分离菌株的PCR产物回收送华大基因测序，测序结果与GenBank中登录的参考株同源性比对鉴定。判定标准：同源性≥99.0%，可以定义到种的水平；若在97.0%～98.9%，定义到属的水平；若小于97.0%，定义为科的水平。

1.2.3 致病性试验

从火烈鸟的病料组织中分离的菌株纯化培养至对数期，采用平板菌落计数法计数菌落，每株分离菌株通过灌胃攻毒方式攻毒5只小白鼠，剂量为0.25 mL(107cfu/mL)，对照组的小白鼠灌胃等量的无菌营养肉汤，观察6 d，每天记录小白鼠的发病与死亡情况，对攻毒死亡的小白鼠剖检并进行细菌分离鉴定。

1.2.4 药敏试验

参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行操作与结果判定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

在沙门菌显色培养基上，疑似沙门菌的分离菌株长出边缘整齐、大小一致的蓝紫色菌落，染色镜检可见无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌，通过生化试验初步鉴定分离的89株菌株为沙门菌。

2.2 细菌PCR鉴定

对生化试验初步鉴定的89株沙门菌，用invA基因引物对进行PCR鉴定。结果显示，从临床中分离的89株沙门菌菌株均扩增出大约为241 bp的目的条带，与预期相符(图1)。这89株沙门菌invA基因测序结果与GenBank参考株的同源性均在97.9%～99.9%，说明其为沙门菌。

图1 细菌PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results of bacteria 注：M.DL2000 DNA Marker；1.空白对照；2～9.分离菌株 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，Blank control.2-9，Isolated strains

2.3 细菌致病性

攻毒组的小白鼠采食量减少，精神沉郁，扎堆与寒颤，水样腹泻，个别的出现急性死亡。试验结束(6 d)，对照组小白鼠健康存活，未出现发病及死亡情况。通过细菌分离鉴定，从发病死亡的小白鼠体内分离得到沙门菌。经统计，发现75株沙门菌能引起小鼠发病。

2.4 药敏试验

对分离的75株致病性沙门菌药敏试验，结果由表1可知，这些沙门菌耐药性严重，对链霉素、阿莫西林、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、阿米卡星、磺胺间甲氧嘧啶和红霉素9种药物耐药率较高，为77.3%～98.7%；对多西环素、环丙沙星、氨曲南、大观霉素和多黏菌素5种药物的耐药率为45.3%～64.0%；对头孢噻呋、头孢噻肟、恩诺沙星和林可霉素4种药物的耐药率较低，为13.3%～22.7%。

表1 火烈鸟腹泻沙门菌的药敏试验结果

2.5 多重耐药性

由表2可知，临床中分离的75株沙门菌呈现多重耐药性，耐17种药物有1株，耐16、7种药物各3株，耐15、9、6种药物各4株，耐14、8种药物各有6株，耐13种药物有5株，耐12、11、10 种药物分离菌株最多，分别占分离菌株的16.0%、18.7%和17.3%。

表2 火烈鸟腹泻沙门菌的多重耐药性检测结果

3 讨论

禽类是沙门菌主要的感染宿主，也是携带者、传播者。沙门菌既能水平传播，又能垂直传播，携带沙门菌的禽类可以通过多种途径传染给其他禽类或通过卵传播给下一代，沙门菌在不同禽类养殖过程中广泛传播，危害较大[6-9]。沙门菌具有多种血清型且具有地区性，给疫苗研制带来一定困难，也是导致该菌在禽类养殖过程中广泛流行的一个重要的因素[9-12]。因此，对沙门菌净化与防控具有重要的意义，2016—2020年，笔者在动物园患腹泻火烈鸟的粪便、肛拭子和死亡火烈鸟的肝脏等102份病料组织中分离得到89株沙门菌，其中75株沙门菌对小白鼠具有致病性，说明动物园中火烈鸟沙门菌感染严重，存在一定的潜在威胁。动物园中火烈鸟感染的沙门菌可能来源于环境中的粪便或者水源，在防控时应该注意粪便的无公害化处理和环境消毒，以及水源的净化与消毒。

沙门菌耐药性问题很普遍，通过多种途径在动物和人之间传播，经成为公共卫生问题[13-14]。本研究表明，分离的75株沙门菌对常用的抗生素产生了很强的耐药性，呈现多重耐药性，耐12、11、10种药物的分离菌株最多，说明动物园中火烈鸟源沙门菌耐药性是普遍存在的，应该引起重视，注意环境净化与病情防控，合理使用抗生素。