贵州茂兰喀斯特地区隐纹花松鼠秋季食性分析

杨舒晗 蔡延芳 王野影 胡灿实 张明明 粟海军*

(1.贵州大学林学院，贵阳，550025；2.贵州大学生物多样性与自然保护研究中心，贵阳，550025；3.贵州师范大学生命科学学院，贵阳，550025；4.贵州大学生命科学学院，贵阳，550025)

食物是野生动物生存的第一要素，生境食物条件与动物觅食行为的共同作用，影响着野生动物个体或种群的分布格局与生存适合度[1-2]，觅食生态学是动物行为生态学的重要研究内容。动物的食性和觅食行为受遗传基因、生活史阶段、种间及种内竞争等因素影响，常形成十分固定的食谱结构和行为模式[3]，因此，掌握物种的食性或觅食行为，是进一步开展物种生态学研究与保护管理的重要基础。

隐纹花松鼠(Tamiopsswinhoei)是广泛分布于我国南方各省森林、林缘和灌木生境的一种松鼠科(Sciuridae)花松鼠属物种[4]。它是一种生性灵活机警、代谢率高、捕食行为频繁的杂食性动物[5]。对于隐纹花松鼠的研究十分少见，主要集中在亚种层次的分类学及生物学描述上[5-7]，生态学上仅有对其栖息环境、活动规律、生活习性等一般性描述[8-9]，对其深入细致的食性分析尚为空白。对松鼠科动物食性的相关报道中，采用的研究方法包括直接观察法、解剖法、粪便显微组织分析法和胃容物分析法等，其中胃容物分析法是国内外研究啮齿动物(Rodetia)食性的主要方法[10]，但传统的胃容物检测方法效率低、误差大[11]。为了准确揭示隐纹花松鼠的食性，本研究运用高通量测序技术测定隐纹花松鼠样本胃容物，以期更为精确地探索喀斯特地区隐纹花松鼠的食性组成，为今后深入研究这一物种提供基础资料。

1 研究区概况

采样地位于贵州省黔南苗族布依族自治州黔、桂交界处的荔波县翁昂乡(图1)，选择2个采样斑块(25°13′ N，107°58′ E)，采样面积约48 hm2，平均海拔780 m，为典型石灰岩地区。该区域属于中亚热带季风湿润气候区，平均气温为15.3 ℃，1月和7月平均气温分别为5.2、23.5 ℃，生长期237 d；全年降水量约1 750 mm，集中分布在4—10月。该区域与荔波世界自然遗产地及茂兰国家级自然保护区相邻，水热条件好，森林植被组成多为典型的中亚热带石灰岩常绿落叶阔叶混交林，区内原生林保存较为完整。茂兰被誉为是地球同纬度地区原生性最强、最具代表性的喀斯特森林生态系统[12-13]。

图1 研究地位置图Fig.1 Location map of the study area 注：A.研究区域在贵州省的位置；B.研究区域样品采集点；C.采样地实景 Note：A，The location of study area in Guizhou Province.B，Sampling sites in the study area.C，The overall landscape view of the study site

2 材料与方法

2.1 材料

2017年10—12月，在贵州荔波茂兰喀斯特林区通过笼捕法收集隐纹花松鼠，随机布笼共捕获19只个体，根据批准的猎取限额取8只成年活体作采样标本(编号WA1～WA4采自斑块1；编号WA5～WA8采自斑块2，均雌雄各半)，其余放归。样本经CO2气体处死后，进行常规生物学测量(性别、体重、体长、尾长、后足长和耳长)，随后立即解剖，取胃置于5%的福尔马林溶液中固定[14]，冰箱中-20 ℃保存。测定的样本信息见表1。

表1 隐纹花松鼠样本信息

2.2 胃容物基因组DNA 的提取

使用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01)提取DNA，用紫外分光光度计测定隐纹花松鼠样本A260值，计算浓度，通过A260/A280值鉴定DNA和RNA纯度，0.8%琼脂电泳验证完整性。

2.3 目的基因片段的PCR扩增与测序

用引物Z1aF(5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′)和hp2R(5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′)对叶绿体rbcL基因进行扩增。用引物COⅠintF(5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′)和COⅠjgHC02198(5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′)对线粒体COⅠ基因进行扩增。PCR反应体系的总体积为25.00 μL，其中包括5×reaction buffer 5.00 μL，5×GC buffer 5.00 μL，dNTP(10 mmol/L)0.50 μL，正向引物(10 μmol/L)1.00 μL，反向引物(10 μmol/L)1.00 μL，DNA模板1.00 μL，ddH2O 11.25 μL，Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL。扩增rbcL和COⅠ基因片段反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保温。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对PCR产物在Microplate reader(BioTek，FLx800)上定量，然后按照每个样品所需的数据量混样。之后送至上海派森诺生物科技股份有限公司平台测序。

3 数据处理与分析

下机数据经过疑问序列的剔除及序列数统计后得到有效数据。应用QIIME软件对序列按照97%的序列相似度归并和操作分类单元聚类分析，产生OTU表并与UNITE数据库(Release 5.0，https：//unite.ut.ee)、Silva数据库(Release115，http：//www.arb-silva.de)、Greengenes数据库(Release 13.8，http：//greengenes. secondgenome.com)比对分类分析，所用平台为QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org)统计后得到个体样本分类鉴定结果。

为了检验试验测序结果的深度，基于OTU聚类分析结果对贵州荔波茂兰喀斯特地区的隐纹花松鼠样本做稀释性曲线分析。为了揭示隐纹花松鼠胃容物的组成，首先在满足正态分布的前提下，对隐纹花松鼠外形进行独立样本t检验；其次，使用QIIME软件，获取各样本在科属分类水平上的植物和动物群落的组成和相对丰度分布，揭示隐纹花松鼠的食性组成。

4 结果与分析

4.1 OTU划分与分类地位鉴定

分别选取隐纹花松鼠叶绿体rbcL基因片段、线粒体COⅠ基因片段，对其胃内容物的植物组成和动物组成进行组分分析鉴定。在植物鉴定中，经Illumina高通量测序共从8个样品中获得目的片段539 008条，样品的序列数最低为50 153条，最高为93 291条，经过聚类共获得295个OTU。在动物鉴定中，共从8个样品中获得目的片段264 983条，样品的序列数最低为29 819条，最高为37 116条，经过聚类共获得1 000个OTU。

4.2 隐纹花松鼠食物的科属分类多样性

通过OTU聚类确定隐纹花松鼠摄食植物有73科109属，样品中壳斗科(Fagaceae)、樟科(Lauraceae)、平藓科(Neckeraceae)、胡桃科(Juglandaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、木犀科(Oleaceae)、扁萼苔科(Radulaceae)、提灯藓科(Mniaceae)、锦藓科(Sematophyllaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、卫茅科(Celastraceae)、木灵藓科(Orthotrichaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、锦葵科(Malvaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、禾本科(Poaceae)、耳叶苔科(Frullaniaceae)和十字花科(Brassicaceae)的总相对读长丰度为0.953 3～0.997 2(图2)，其中壳斗科相对读长丰度最大(0.030 9～0.964 5)，然后为樟科(0.003 6～0.487 3)、平藓科(0.001 2～0.277 0)、胡桃科(0.003 7～0.368 8)、毛茛科(0.001 2～0.174 4)、山茱萸科(0.001 9～0.242 2)、木犀科(0.000 9～0.220 9)、扁萼苔科(0.000 5～0.086 1)、提灯藓科(0.000 2～0.081 1)、锦藓科(0.000 1～0.045 7)、五加科(0.000 6～0.007 6)、石竹科(0.000 2～0.035 9)、卫茅科(0.000 3～0.031 4)、木灵藓科(0～0.020 6)、罂粟科(0.000 1～0.023 0)、锦葵科(0～0.016 6)、番荔枝科(0.000 1～0.016 5)、禾本科(0～0.013 2)、耳叶苔科(0～0.012 2)和十字花科(0～0.010 6)。

图2 茂兰隐纹花松鼠胃容物样品中平均相对读长丰度最高的20科植物Fig.2 The top 20 plant families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由图3可见，在属水平上，样品中栎属(Quercus)、杯托樟属(Aiouea)、狄氏藓属(Dixonia)、烟包树属(Engelhardia)、山茱萸属(Cornus)、素馨属(Jasminum)、唐松草属(Thalictrum)、铁线莲属(Clematis)、扁萼苔属(Radula)、丝瓜藓属(Pohlia)、刺疣藓属(Trichosteleum)、南洋参属(Polyscias)、孩儿参属(Pseudostellaria)、卫矛属(Euonymus)、木灵藓属(Orthotrichum)、荷青花属(Hylomecon)、棉属(Gossypium)、瓜馥木属(Fissistigma)、耳叶苔属(Frullania)和芸薹属(Brassica)的总相对读长丰度为0.952 8～0.995 6，其中栎属的相对读长丰度最高(0.028 2～0.963 2)，然后为杯托樟属(0.003 5～0.482 9)、狄氏藓属(0.001 2～0.277 0)、烟包树属(0.003 7～0.368 8)、山茱萸属(0.001 9～0.242 2)、素馨属(0.000 9～0.220 9)、唐松草属(0.000 7～0.172 5)、铁线莲属(0.000 4～0.140 5)、扁萼苔属(0.000 5～0.086 1)、丝瓜藓属(0.000 2～0.081 1)、刺疣藓属(0.000 1～0.045 6)、南洋参属(0.000 6～0.007 6)、孩儿参属(0.000 2～0.035 9)、卫矛属(0.000 3～0.031 2)、木灵藓属(0～0.020 6)、荷青花属(0.000 1～0.023 0)、棉属(0～0.016 6)、瓜馥木属(0.000 1～0.016 1)、耳叶苔属(0～0.012 2)和芸薹属(0～0.010 6)。

图3 茂兰隐纹花松鼠胃容物样品中平均相对读长丰度最高的20属植物Fig.3 The top 20 genre with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

通过OTU聚类确定隐纹花松鼠摄食动物有82科120属，由图4可见，样品中刺蛾科(Limacodidae)、蝽科(Pentatomidae)、匍蠊科(Blaberidae)、步行虫科(Carabidae)、叶甲科(Chrysomelidae)、海蛄虾科(Thalassinidae)、伪瓢虫科(Endomychidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、思蒂格诺盲蛛科(Stygnopsidae)、蚊科(Culicidae)、厕蝇科(Fanniidae)、天牛科(Cerambycidae)、蝗科(Acrididae)和丽蝇科(Calliphoridae)的总相对读长丰度为0.000 5～0.848 7，其中刺蛾科相对读长丰度最大(0～0.780 0)，然后为蝽科(0～0.186 8)、匍蠊科(0～0.074 8)、步行虫科(0～0.071 6)、叶甲科(0～0.034 5)、海蛄虾科(0～0.031 6)、伪瓢虫科(0～0.031 7)、蠓科(0～0.026 8)、思蒂格诺盲蛛科(0～0.012 3)、蚊科(0～0.020 9)、厕蝇科(0～0.015 1)、天牛科(0～0.005 3)、蝗科(0～0.007 8)和丽蝇科(0～0.003 2)。

图4 茂兰隐纹花松鼠胃容物样品中平均相对读长丰度最高的14科动物Fig.4 The top 14 animal families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由图5可见，在属水平上，样品中Natada、茶翅蝽属(Halyomorpha)、Nebria、Thyant、海蛄虾属(Thalassina)、Indalmus、库蠓属(Culicoides)、库蚊亚属(Culex)、厕蝇属(Fannia)、通缘步甲属(Pterostichus)和雏蝗属(Chorthippus)的总相对读长丰度为0.000 3～0.814 2，其中Natada的相对读长丰度最大(0～0.814 2)，然后为茶翅蝽属(0～0.186 8)、Nebria(0～0.071 6)、Thyanta(0～0.034 5)、海蛄虾属(0～0.031 7)、Indalmus(0～0.026 8)、库蠓属(0～0.012 3)、库蚊亚属(0～0.015 1)、厕蝇属(0～0.005 3)、通缘步甲属(0～0.007 8)和雏蝗属(0～0.004 3)。

图5 茂兰隐纹花松鼠胃容物样品中平均相对读长丰度最高的11属动物Fig.5 The top 11 genre with the highest average relative read length and abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

5 讨论

动物食性分析方法的精确性直接关系到食性相关理论的研究水平，也关乎食性结果应用于动物保护的实践[15]，所以选择合适的食性研究方法至关重要。胃容物分析法是通过采集的胃样，分析食物组成，以准确确定动物食性的一种方法[16]。高通量测序是DNA测序技术发展中的重大突破，可以对数百万个DNA分子同时测序[17-19]，避免分离或纯化的过程便可得到丰富的物种信息，只需对PCR产物直接测序[20]，从而可忽略动物本身序列产生的影响[21]，以获取信息量大、成效快等特点被广泛地应用于动物食性研究中[22-24]。采用胃容物高通量测序技术分析啮齿动物食性，相对于传统食性分析方法，具有不依赖于研究者的经验和主观判断，不受食物消化程度和硬质残留比例的局限等优点，大幅提高了食物物种辨识的准确度和可信度[11，20]，可最大限度地揭示食物种类组成[25]，获得物种所消耗的不同食物相对量的定量数据[11，20]。但高通量测序技术也存在一定的缺陷性和不确定性，扩增区域的选择、模板DNA的质量、PCR、读长的清晰度和解析度、数据库的完善及该技术本身等均会对研究结果产生一定的影响。

本研究结果中，摄食植物中的杯托樟属，通过查找其分布发现，该属物种主要分布在新热带界，而古北界及东洋界一带暂无分布记录，分析其首要原因可能是国内对于该属物种缺乏研究，相关报道非常少；其次可能是物种注释的问题，按照97%的序列相似度归并的分析标准会影响到高通量测序对某些物种鉴别的精准度，导致该属的分辨率不够清晰，注释到近缘属物种的情况。在摄食动物中，也存在此现象。对此，可考虑采取其他方法与之相结合达到更优的鉴定结果。刘刚等[11]曾表明，在同一个研究中，通过开展高通量测序与另一种食性分析方法的结合是验证数据准确性的有效途径，已有学者证实，通过与摄像机结合等方式可起到互补验证作用[15]，因此，本研究结果还需结合其他食性分析方法，做进一步地补充和验证。虽然高通量测序技术还存在一定的局限，但不断完善和具备的定量特征，以及各种分析软件的日渐成熟，目前仍然可被广泛应用于食物组成的评估研究[15]。

在已有研究报道中，采取野外观察和夹日法捕获花鼠(Eutamiassibiricus)对其颊囊食物在解剖镜下分类，对胃解剖发现花鼠春季主要取食多年生早春杂草，夏季主要取食浆果和经济类水果，也取食一些小型动物及昆虫，秋季主要取食向日葵(Helianthusannuus)种子和大田作物，冬季进入间歇性冬眠[26]。本研究结果表明，贵州荔波茂兰喀斯特地区隐纹花松鼠为杂食性动物，摄食植物多达73科109属，其中栎属、杯托樟属、狄氏藓属、烟包树属、山茱萸属、素馨属、唐松草属、铁线莲属、扁萼苔属和丝瓜藓属为其偏好性植物，且壳斗科栎属为最重要的食物来源；摄食动物82科120属，其中Natada、茶翅蝽属和Nebria取食量在动物食源中占比相对更大，表明隐纹花松鼠摄食食物类型丰富，是偏植食性杂食动物。

荔波茂兰地区为典型喀斯特中亚热带喀斯特森林生态系统，林分保存较好，以天然次生林为主，尤其壳斗科植物丰富[27]，果实热量高，适口性好，极易被取食，果期10—11月，与本研究采集样本的时间耦合，该时期食物资源丰富，可为接下来入冬的隐纹花松鼠生存提供保障。本研究在测量样本信息时发现，2个采样斑块的样本在体重上有着明显差异(斑块1样本平均体重109.3 g，而斑块2样本平均体重仅为66.4 g)，样本经生殖器和妊娠检验，均为成体(雌性排除妊娠情况)，年龄差异应不可能造成如此悬殊的情况，从两地个体的食性构成(图3，图4)来看，未发现两采样斑块种群食性有明显特征差异，这一现象有待进一步采样并探究其原因。

啮齿动物取食食谱受自然环境中食物资源状况影响，不同季节资源状况可能也不尽相同[28]。本次采集隐纹花松鼠样本的时间为10—12月，如果要全面了解各季节时段的食性，还需连续采集不同季节的样本，进一步研究全年的食性规律。