基于mtDNA D-loop区和Cyt b基因序列对鹅喉羚南疆亚种遗传多样性与系统进化地位的分析

张永浩 韦庆浩 郭丽君 阿布都热合曼·吐尔逊 王玉涛

(喀什大学生命与地理科学学院，新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，喀什，844000)

鹅喉羚(Gazellasubgutturosa)又称长尾黄羊，属偶蹄目(Artiodactyla)反刍亚目(Ruminantia)牛科(Bovidae)羚羊亚科(Antilopinae)瞪羚属[1]，雄性鹅喉羚在发情时期喉部会膨大(即甲状腺肿)，形似鹅喉，因此称其为鹅喉羚。据报道[2]，鹅喉羚有6个亚种，在新疆境内分布3种，近50年，由于人为因素(包括牧业的发展、过度捕猎和居民点扩充等)和自然灾害(全球气候变化、风雪严寒引起的食物短缺等)的影响，该物种的栖息环境越来越差，活动范围逐渐缩小，种群数量也迅速减少，面临更加严重的生存危机[3-5]。鹅喉羚已被列为国家二级重点保护野生动物，IUCN红色名录VU级(易危种)[6]，《中国脊椎动物红色名录》易危物种(VU)[7]。

鹅喉羚多栖息于荒漠和半荒漠地区，以及沙土和黏土至盐滩及沙漠类型的区域。鹅喉羚全球分布广泛，从伊朗、阿拉伯半岛、中亚和阿富汗，向东拓展至中国的西北地区和蒙古境内的广大区域[8]。雌性鹅喉羚生角部位显著凸起，雄兽具角，角长22～30 cm[9]。我国学者[10-11]已对鹅喉羚进行了多方面的研究，如形态与分类学、栖息地的选择和觅食繁殖等，也有学者[12-13]将鹅喉羚的研究动态进行了整理，对其分类、地理分布、种群数量、生理、生化、细胞生物学、生态生物学和饲养繁殖与疾病防治进行了总结，探讨致危因素，提出保护对策，然而，从遗传多样性和系统发育地位为切入点，对鹅喉羚南疆亚种(G.s.yarkandensis)的保护制定合理措施的研究鲜有报道，本研究将弥补这一空缺。

线粒体DNA(mtDNA)是动物体内唯一的核外遗传物质，呈共价闭合环状，且为双链DNA，序列长15～20 kb，分子质量极小[14]。在哺乳纲(Mammalia)动物中，编码区和非编码区构成了完整的mtDNA结构，37个基因的编码序列呈线性排列在编码区，包括13个编码蛋白质的基因、22个编码tRNA的基因和2个编码rRNA的基因。mtDNA从雌性亲本个体传递给子代，过程中没有发生基因重组现象，后代中的某一个体可以代表其母系群体的遗传结构，能够保留祖先的特性并记录之前出现的进化事件，但是线粒体基因比核基因更容易受遗传漂变的影响[15]。基于mtDNA的以上特点，mtDNA分子标记技术在脊椎动物群体遗传学、分子遗传学和母系起源等领域的研究中得到普遍运用。随着分子生物学的飞速发展，人们对Cytb基因的结构了解越来越深入，它的相对分子质量约为427 000[3，16]，密码子的第3位点进化最快，而第2位点最保守[17]。为明确鹅喉羚南疆亚种遗传多样性水平、遗传分化和系统进化地位，以鹅喉羚南疆亚种为研究对象，采用PCR和测序技术，研究mtDNA D-loop区和mtDNACytb基因的序列特征，下载GenBank中鹅喉羚基因序列，利用MEGA 6.06构建系统发育树和中介网络关系，以阐明鹅喉羚南疆亚种遗传多样性水平和系统地位，为鹅喉羚的相关研究提供基础数据，也为鹅喉羚南疆亚种遗传资源保护和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在叶城地区采集到鹅喉羚3份肌肉样本，在英吉沙县和莎车县分别采集到3份和8份耳部样本，共采集14份样本(分属于14只个体)，均来自南疆地区，系野外死亡个体，将样本编号后冻存(-80 ℃)于新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 样本处理及DNA提取

取50～100 mg样本，用剪刀尽量剪碎，装于高压灭菌过的2 mL离心管中，加入800 μL STE抽提液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)充分混匀15 min，消化过夜后用常规酚-氯仿法提取总基因组DNA[18]。

1.2.2 PCR扩增

mtDNACytb基因上游引物为5′-GATATGAAAAACCATCGTTG-3′，下游引物为5′-CCTTCTCTGGTTTACAAGAC-3′[19]。反应总体系为50.5 μL，其中，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 30.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 16.0 μL。反应程序为 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。mtDNA D-loop区上游引物为5′-CCACTATCAACACCCAAAGCTG-3′，下游引物为5′-GCATTTTCAGTGCCTTGCT-3′[20]。总反应体系为50.5 μL，其中，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 30.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 16.0 μL。反应程序为 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，61.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.2.3 PCR扩增产物凝胶电泳及送样测序

PCR扩增后的产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，若目的条带清晰整齐，条带较亮，无杂带，且mtDNACytb基因片段长度与预期的1 100 bp相近，mtDNA D-loop区序列片段长度与预期的1 000 bp相近，即可由苏州金唯智生物科技有限公司进行正反向测序。

1.3 数据分析

通过Chromas version 2.65软件对DNA测序仪产生的原始序列峰图数据进行人工校对。在MEGA 6.06中对mtDNA D-loop区和mtDNACytb基因的序列测定结果进行人工多序列同源比对，辅以Clustal软件校对，校对后的文件保存为Fasta和MEGA格式。采用DnaSP v5软件计算核苷酸多样度、单倍型多样度和平均核苷酸差异数。用MEGA 6.06软件构建单倍型系统发育树，分析样品网络结构。

2 结果与分析

2.1 鹅喉羚mtDNA D-loop区和Cyt b基因组成

由图1可见，mtDNA D-loop区和Cytb基因PCR扩增产物测序结果较好，杂峰、套峰少，波谷波峰界限明确，不存在误读情况，可进行后续序列分析。

图1 鹅喉羚mtDNA D-loop区和Cyt b基因PCR产物测序结果Fig.1 PCR products sequencing results of mtDNA D-loop region and Cyt b gene in Gazella subgutturosa

将mtDNA D-loop区的测序结果和GenBank中的鹅喉羚mtDNA控制区序列进行同源对比，最终获得14条线粒体控制区序列，长度为791 bp。使用MAGE 6.06对所得序列进行分析，结果显示：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的平均含量分别为33.18%、27.20%、21.87%和17.75%，其中鸟嘌呤含量最低，A+T的平均含量为60.38%，G+C的平均含量为39.62%，碱基组成存在明显的偏向性，这一特征符合脊椎动物mtDNA的序列特征。

将mtDNACytb基因的序列测序结果和GenBank中鹅喉羚mtDNACytb基因序列进行同源对比，最终获得14条线粒体控制区序列，长度为1 084 bp，这与哺乳动物Cytb基因扩增长度1 100～1 200 bp的结果[21]基本吻合。使用MAGE 6.06分析所得序列，结果显示：A、T、C和G的平均含量分别为31.58%、26.71%、28.71%和13.01%，其中鸟嘌呤的含量最低，G+C的平均含量(41.72%)显著低于A+T的平均含量(58.39%)，与mtDNA D-loop区类似，具有明显的碱基偏向性，这一特征同样符合脊椎动物的基因序列特征。

2.2 鹅喉羚单倍型多样性

通过DnaSP v5软件对14条鹅喉羚mtDNA D-loop区序列进行多态性分析，结果显示共存在7种单倍型(Hap1～Hap7)，其中有3种为共享单倍型，Hap3有2个个体，Hap5有6个个体，Hap6有2个个体，占总单倍型的42.86%；4个为单一单倍型，Hap1、Hap2、Hap4、Hap7，占总单倍型的57.14%。在莎车县采集的8个样本属于2个单倍型，分别为Hap5和Hap6；在叶城县采集的3个样品属于3个单倍型，分别为Hap2、Hap3和Hap4；在英吉沙县采集的3个样本属于3个单倍型，其中1个与叶城县采集的样本为共享单倍型Hap3，另外2个单倍型为Hap1和Hap7(表1)。本研究检测到保守性位点共762个，多态性位点共23个，占总位点数的2.90%，其中包括单一多态位点8个，位于第60、84、157、213、221、241、358和771碱基位，简约性信息位点15个，位于第135、142、199、200、246、337、356、357、440、455、722、723、729、741和743碱基位。

表1 鹅喉羚南疆亚种mtDNA D-loop区的7个单倍型变异序列

通过DnaSP v5软件对14条鹅喉羚mtDNACytb基因序列进行多态性分析，结果显示：存在5个多态性位点，共4种单倍型(Hap1～Hap4)，其中有3种为共享单倍型：Hap1有5个个体，Hap2有6个个体，Hap4有2个个体，占总单倍型的75%；Hap3为单一单倍型，占总单倍型的25%。在莎车县采集的8个样本属于2个单倍型，分别为Hap2和Hap4；在叶城县采集的3个样品属于2个单倍型，分别为Hap1和Hap3；在英吉沙县采集的3个样品与在叶城县采集的2个样品属于共享单倍型Hap1(表2)。通过DnaSP v5软件对14条基因序列的1 084个位点进行检测，没有检测到碱基插入和缺失。本研究检测到保守性位点共1 079个，多态性位点共5个，占总位点数的0.46%，其中包括单一多态位点1个，位于第558碱基位，简约性信息位点4个，分别位于第130、525、615和690碱基位。

表2 鹅喉羚南疆亚种mtDNA Cyt b基因的4个单倍型变异序列

2.3 鹅喉羚的遗传多样性

14只鹅喉羚南疆亚种的mtDNA D-loop区序列、mtDNACytb基因平均单倍型多样度分别为0.813和0.714，核苷酸多样度为0.008 90和0.001 59，平均核苷酸差异度为7.747和1.725，表明鹅喉羚南疆亚种mtDNA D-loop区和mtDNACytb基因的单倍型多样度水平较高，核苷酸多样度水平低，遗传多样性较高。

2.4 鹅喉羚的系统发育

结合所得数据，下载GenBank中瞪羚属的mtDNA D-loop区同源序列，比对分析共获得36条长度为1 084 bp的序列，经单倍型分析后获得29条序列。使用MAGE 6.06的Kimura 2-parameter(双参数)模型，用邻接法构建NJ系统发育树，对拓扑图进行自展检验，重复抽样次数设置为1 000，以GenBank中山瞪羚(Gazellagazella)mtDNA D-loop区的序列作为外群，结果见图2。本研究中的7种单倍型与山瞪羚位于完全不同的2个进化支系上，表明亲缘关系较远；单倍型Hap1、Hap2、Hap4、Hap6、Hap3和Hap7聚类于进化支系E，Hap5聚类于进化支系F，且进化支系E和F中还包含了GenBank中鹅喉羚南疆亚种的序列，表明同一亚种的亲缘关系较近，7种单倍型聚类于进化支系I。

图2 鹅喉羚mtDNA D-loop区序列单倍型的NJ系统发育进化树Fig.2 NJ phylogenetic tree constructed by the sequence haplotypes in the mtDNA D-loop region of Gazella subgutturosa

结合所得数据，下载GenBank中瞪羚属mtDNACytb基因同源序列，将测序获得的序列比对和矫正，共获得35条长度为1 084 bp的序列，经单倍型分析后获得25条序列。以印度瞪羚(Gazellabennettii)的mtDNACytb基因序列作为外群，结果见图3。4种单倍型聚类于进化支系Ⅰ，且其中3种单倍型与GenBank中南疆亚种位于同一进化支系C，1种单倍型与GenBank中鹅喉羚北疆亚种(Gazellasubgutturosasairenses)位于同一进化支系D，说明亲缘关系南疆亚种高于北疆亚种。

图3 鹅喉羚mtDNA Cyt b基因序列单倍型的NJ系统发育进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree constructed by the sequence haplotypes of mtDNA Cyt b region of Gazella subgutturosa

2.5 鹅喉羚网络关系

使用MEGA 6.06构建的南疆亚种鹅喉羚和GenBank中下载的20条mtDNA D-loop区序列的网络关系(图4)与系统发育树显示的结果(图2)一致。鹅喉羚与山瞪羚(Hap8)呈现明显不同的2个分支，且鹅喉羚的各亚种聚为2个分支，未出现低频单倍型以高频单倍型为中心的散射分布，说明单倍型的遗传结构比较单一，基因交流较少。

图4 鹅喉羚各亚种间mtDNA D-loop区序列网络关系图Fig.4 Sequence network diagram of mtDNA D-loop region among various subspecies of Gazella subgutturosa 注：GSY.鹅喉羚南疆亚种；GSS.鹅喉羚北疆亚种；GSM.鹅喉羚阿拉伯亚种；GSSu.鹅喉羚指名亚种；GG.山瞪羚 Note：GSY，Gazella subgutturosa yarkandensis.GSS，Gazella subgutturosa sairenses.GSM，Gazella subgutturosa marica.GSSu，Gazella subgutturosa subgutturosa.GG，Gazella gazella

使用MEGA 6.06构建的南疆亚种鹅喉羚和GenBank中下载的23条mtDNACytb序列的网络关系(图5)与系统发育树显示的结果(图3)一致。鹅喉羚与印度瞪羚(Hap14)属于不同分支，且鹅喉羚的各亚种聚为2个分支，未出现低频单倍型以高频单倍型为中心的散射分布，说明倍型的遗传结构比较单一，基因交流较少。

图5 鹅喉羚各亚种间mtDNA Cyt b基因序列网络关系图Fig.5 Sequence network diagram of mtDNA Cyt b region among various subspecies of Gazella subgutturosa 注：GSY.鹅喉羚南疆亚种；GSS.鹅喉羚北疆亚种；GSM.鹅喉羚阿拉伯亚种；GSSu.鹅喉羚指名亚种；GB.印度瞪羚 Note：GSY，Gazella subgutturosa yarkandensis.GSS，Gazella subgutturosa sairenses.GSM，Gazella subgutturosa marica.GSSu，Gazella subgutturosa subgutturosa.GB，Gazella bennettii

3 讨论

本研究对14只鹅喉羚南疆亚种mtDNACytb基因进行分析，在4种碱基中，鸟嘌呤的含量最低，G+C的平均含量(41.72%)显著低于A+T的平均含量(58.28%)，与mtDNA D-loop区序列类似，具有明显的碱基偏向性，这一特征符合脊椎动物的基因序列特征。鹅喉羚南疆亚种平均单倍型多样度为0.714，核苷酸多样度为0.001 59，表明mtDNACytb基因的单倍型多样度水平较高，遗传多样性较高，但与董潭成等[22]对卡拉麦里山鹅喉羚mtDNACytb基因的研究结果对比，2个参数均有减弱趋势；相比于夏米西丁·阿不都热依木[23]对新疆鹅喉羚mtDNACytb基因的研究，本研究所得的核苷酸多样度较高，平均单倍型多样度略低。因此，应完善南疆喀什地区鹅喉羚栖息地的保护措施，为其种群提供适合的栖息地环境，可参照马可·波罗盘羊(Ovisammonpolii)保护措施建立鹅喉羚生态公园，进行人工扩繁，同时开展精、卵冷冻保存库离体保护[24]。为全面反应群体的多样性水平，还需要基于更多的基因对遗传多样性开展进一步研究。

鹅喉羚南疆亚种与其他亚种间不存在共享单倍型，可能是因为鹅喉羚在迁徙到叶尔羌河流域后，与其他地区鹅喉羚群体间基因交流较少，经过长期的适应性进化，形成了独特的遗传结构，成为现今的南疆亚种。鹅喉羚南疆亚种的保护措施应进行完善和加强，尤其是近几年冬季气温不断降低，降雪量增加，对鹅喉羚冬季的生存，尤其是觅食造成了很大的影响，建议有关部门在冬季采取适当措施以降低鹅喉羚冬季觅食的难度。