双丁注射液和鱼腥草注射液联合应用对青海地区奶牛隐性乳房炎的防治效果

姜现垒，苏建民*，张成图

(1.西宁市动物疫病预防控制中心，青海西宁 810016；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

奶牛隐性乳房炎是奶牛业中易发生、危害大、防控难的一种疾病，会造成奶牛乳品质下降、产奶量降低和过早淘汰等问题，给奶牛业造成巨大经济损失。在发达国家，奶牛隐性乳房炎的发病率达到30%～70%[1]。奶牛隐性乳房炎的危害远远高于临床型乳房炎，对奶牛的健康问题和危害也更大。奶牛乳房炎是由多种病原微生物和环境的多重影响引起的，尤其是黄金葡萄球菌、大肠埃希氏菌和无乳链球菌等[2]。目前，抗生素作为治疗大多数疾病和奶牛乳房炎的主要药物，但不规范使用抗生素也造成了耐药问题。我国畜牧业长期无节制地大剂量使用抗生素已经造成了耐药株的增加，很多广谱抗生素已经不是治疗乳房炎的首选药物。

中草药具有毒性低、残留少疗效好等优点，还具有不易造成细菌耐药和不易导致抗生素残留等优点。在兽医临床治疗中，中草药已广泛用于奶牛乳房炎的防治工作并取得较好的治疗价值。其中，鱼腥草、蒲公英和紫花地丁具有较强的抗菌活性，对黄金葡萄球菌和大肠埃希氏菌等具有较好的抗菌效果[3,4]。因此，探究中草药对奶牛隐性乳房炎的防控和治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 试验中的乳汁和血液均采自青海省圣亚高原牧场的荷斯坦奶牛。

1.1.2 主要试剂 双丁注射液、鱼腥草注射液，西乡长江动物药品有限责任公司产品；注射用氨苄西林钠，河北远征药业有限公司产品；加州乳房炎测试液(CMT)，南京茂捷微生物科技有限公司产品；髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司产品；N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)测定试剂盒、丙谷转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)测定试剂盒、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)测定试剂盒、谷氨酰胺转移酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)测定试剂盒、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)测定试剂盒、直接胆红素(direct Bilirubin,DBIL)测定试剂盒、间接胆红素(indirect Bilirubin,IDBIL)测定试剂盒、葡萄糖(glucose,GLU)测定试剂盒、总胆固醇(total cholesterol,T-CHOL)测定试剂盒、甘油三酯(triglyceride,TG)测定试剂盒，湖南永和阳光生物科技股份有限公司产品；AccuStain Solution、Accuchip、体细胞计数试剂盒，韩国NanoEnTek公司产品。

1.1.3 主要仪器 全自动血液生化分析仪(AFS4000)，湖南永和阳光生物科技股份有限公司产品；乳品质快速分析仪(MilkoScan FT120)，丹麦福斯集团公司产品；Adam全自动活细胞计数与活力分析仪(ADAM MC Auto Cell Counter)，韩国NanoEnTek公司产品；超微量微孔板分光光度计(Epoch)，美国伯腾仪器有限公司产品；高速冷冻离心机(Micro21R)，赛默飞世尔科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 本研究以青海省圣亚高原牧场中泌乳正常且无临床型乳房炎症状的20头荷斯坦奶牛为研究对象。采用加州乳房炎诊断液进行检测，共筛选出9头阳性牛，将9头阳性牛随机分为2组分别用中药和抗生素进行治疗。中药治疗组(TCM group)为5头(双丁注射液：肌肉注射，0.1 mL/kg，一日1次，连用8 d；鱼腥草注射液：肌肉注射，20 mL，一日1次，连用8 d)；抗生素治疗组(antibiotic group)为4头(氨苄西林钠注射液：肌肉注射，20 mg/kg，一日2次，连用8 d)；健康对照组(healthy control group)为5头(正常饲喂)。将试验奶牛分别进行编号，通过测定不同组别奶牛在1 d、3 d、6 d、12 d时的治疗效果、体细胞数变化、产奶量、血清生化指标、乳品质和乳酶活性进行综合评价。

1.2.2 隐性乳房炎的检测 采集乳样时，弃去前3把奶，取不同乳区奶样，分别加入2 mL奶样于白色检验皿的4个小盘内，每个小盘内再加入CMT检验液2 mL，平稳做同心圆摇动检验皿，约10 s后观察混合物性状，根据说明书判定结果。采集检出结果为阳性的奶样，置于经高压灭菌的10 mL离心管中，标明所采样品的编号、日期等，冷藏并尽快运送至实验室。

1.2.3 体细胞数的测定 采用牛博士 Ⅲ 型体细胞检测仪进行检测，将采集的乳汁样品用纱布过滤后，分别加入100 μL乳汁和100 μL染色液于同一个离心管中，充分摇匀10 s以上。混合静置1 min后开始检测，将混合液缓慢匀速注入检测芯片中，此时避免注入气泡防止影响试验结果。最后，将芯片按照箭头方向插入芯片槽，记录数据。

1.2.4 治疗效果的统计 对患病奶牛治疗1 d、3 d、6 d、12 d后，在同一时刻记录奶牛进食状况、乳房外观变化情况。分别采集患病牛的奶样，记录体细胞变化并评估治疗效果。具体治疗情况判定标准如下：乳区无明显临床症状，乳汁颜色和产奶量正常，体细胞数小于50万/mL，停药后2周内仍处于正常状态，记为痊愈；乳区仍有轻微症状，体细胞明显降低，但是大于50万/mL，记为好转；相比治疗前没有区别甚至更加严重，体细胞数变化不大甚至升高，记为无效。

1.2.5 产奶量的测定 采集乳汁前，对奶牛乳房、乳头及挤奶人员的手部进行清洗，用热毛巾和酒精对奶牛乳房进行擦拭和消毒。对3组奶牛产奶量的统计分别定于每天的上午8点进行。

1.2.6 血清生化指标的测定 奶牛于早晨饲喂前采集血样，分别用负压采血管在奶牛的尾静脉进行采血，之后将收集的血液置于37℃样品箱中放置30 min，待其凝固后3 000 r/min离心10 min，收集血清置于-20℃冰箱用于后续检测。血液生化指标采用全自动血液生化分析仪进行分析，测定程序根据说明书进行操作。

1.2.7 乳品质的测定 乳品质用FOSS FT-120乳品质快速分析仪进行测定。测定前用纱布滤去牛乳中的杂质并置于37℃水浴锅中加热5 min。将乳品质快速分析仪进行调零和清洗过后进行测定，完成测定后读取各成分数据。

1.2.8 乳酶活性的测定 将带回的牛乳在4℃下3 000 r/min离心5 min，去除乳脂后在4℃下16 000 r/min离心30 min，收集到的乳清保存在-80℃冰箱备用。乳酶活性的测定根据说明书要求进行操作。

1.2.9 数据分析 统计数据使用SPSS19.0软件(SPSS Inc.，美国)分析评估。结果图片使用GraphPad Prism6软件进行绘制。数据以平均值±标准误的形式表示。当进行多次比较时，使用单因素方差分析ANOVA检测；P<0.05为数据差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 隐性乳房炎的检出率

使用加州乳房炎测试液对无临床型乳房炎症状的20头奶牛进行检测，阳性检测盘中出现沉淀物和凝集物，液体有一定黏附性；阴性检测盘中液体流动正常，无沉淀物和凝集物出现。结果发现体细胞数大于50万/mL的奶牛有9头，隐性乳房炎检出率达到45%。

2.2 体细胞的测定

经过不同方案治疗后，体细胞数变化如表1所示。发现患病奶牛每毫升乳汁的体细胞数在80万/mL～100万/mL之间。经过不同方案治疗后，两组的体细胞数均明显下降。经中药治疗12 d后的奶牛乳汁中的体细胞数基本趋于正常，显著低于抗生素组(P<0.05)。

2.3 对治疗效果的影响

经过不同方案治疗后，两组的治疗效果如表2所示。抗生素组治疗的乳区为16个，治愈13个，有效为1个，无效为2个，治愈率为81.33%，有效率87.5%，无效率12.5%；中药组治疗乳区为20个，治愈数为18个，有效为1个，无效为1个，治愈率为90%，有效率95%，无效率5%。

2.4 对产奶量的影响

如表3所示，患病奶牛的产奶量显著低于健康奶牛(P<0.05)；抗生素组在治疗前的平均产奶量为14.37 kg/头，治疗后的平均产奶量增加至18.23 kg/头，平均产奶量净增加3.86 kg/头；中药组在治疗前，平均产奶量为15.07 kg/头，治疗后的平均产奶量增加至23.53 kg/头，平均产奶净增加8.46 kg/头。

2.5 对血清酶理化性质的影响

患病奶牛血清中的ALT、AST、ALP和GGT活性明显高于健康奶牛，并且随着治疗天数的增加而降低。在治疗12 d后，中药组在ALT、AST、ALP和GGT的活性总体与抗生素组无显著性差异；在12 d时，中药组的AST活性显著低于健康组(P<0.05)，而抗生素组与健康组无明显差异。患病奶牛血清中TBIL、DBIL、IDBIL的浓度和GLU、T-CHOL、TG的含量明显高于健康奶牛，并且随着治疗天数的增加而降低。在治疗12 d后，中药组在TBIL、DBIL、IDBIL的浓度和GLU、T-CHOL、TG的含量总体与抗生素组无显著性差异；在12 d时，中药组的TBIL浓度显著高于抗生素组(P<0.05)。在3 d时，中药组的TG的浓度显著高于抗生素组(P<0.05)；在6 d时，中药组的TG的浓度显著高于健康组(P<0.05)，而抗生素组与健康组无显著性差异。

表1 治疗后体细胞数变化

表2 治疗效果的影响

表3 治疗后产奶量的变化

2.6 对乳品质的影响

患病奶牛的乳脂、乳糖和非脂固体含量明显低于健康奶牛，并且随着治疗天数的增加而升高；而患病奶牛的乳蛋白含量明显高于健康奶牛，并且随着治疗天数的增加而降低。在12 d时，抗生素组的乳脂含量显著低于健康组(P<0.05)，而中药组与健康组无显著性差异。在6 d和12 d时，抗生素组的乳糖含量显著低于健康组(P<0.05)，而中药组与健康组无显著性差异。在治疗6 d后，中药组的乳蛋白含量显著低于抗生素组(P<0.05)。

2.7 对乳酶的影响

患病奶牛的N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶、髓过氧化物酶、乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶的活性明显高于健康组，并且随着治疗天数的增加而降低。在治疗12 d后，中药组和抗生素组对ALP的活性无显著性差异。在3 d和6 d时，抗生素组的NAG活性显著高于中药组(P<0.05)。在3 d、6 d和12 d时，抗生素组的LDH活性显著高于中药组(P<0.05)。在3 d时，抗生素组的MPO活性显著高于中药组(P<0.05)；在12 d时，抗生素组的MPO活性显著高于健康组(P<0.05)，而中药组与健康组无显著性差异。

3 讨论

乳房炎的发生与饲养环境、遗传因素、病原菌种类等都有很大关系，这也是该病频发和难于防治的主要原因。我们的检出率与辽西地区41.25%[5]和河南地区46.5%[6]基本一致。明显高于张万元等[7]曾报道的青海省西宁市互助县东沟乡29.72%、威远镇54.10%、巴扎乡26.45%、东和乡31.86%、南门峡镇29.34%和加定镇22.72%的隐性乳房炎检出率情况。奶牛隐性乳房炎检出率的上升可能与饲养环境和病原菌的耐药性有关。有研究证明[8]，甘草总黄酮混悬液注射液对奶牛乳房炎治疗的治愈率和有效率分别高达87.17%和97.44%，而抗生素组的治愈率和有效率分别为86.84%和93.42%。总体来说，中药组在治愈率上高于抗生素组，而抗生素较高的无效率可能与细菌耐药有关。高蓉彬等研究发现[9]，高、中、低剂量组加减瓜蒌散和环丙沙星对治疗奶牛乳房炎的有效率分别为94.44%、85.71%、69.44%和63.89%。奶牛隐性乳房炎发生后，乳腺上皮细胞和乳腺导管会遭到破坏，会导致血乳屏障的破坏和产奶量的下降。有研究报道[10]，患有乳房炎的奶牛经过中药治疗后的产奶量远高于抗生素治疗，可能与中草药对乳腺上皮细胞和乳腺导管的修复作用有关。我们的结果表明，中药组对治愈率、产奶量、体细胞数的恢复效果均好于抗生素组，抗生素组具有较高的无效率可能与致病菌产生耐药性有关。

肝脏功能评价是对药物治疗效果评价中的必要环节。血清酶是评价机体器官是否正常的指标，其中ALT、AST、ALP、GGT是评价肝细胞损伤的主要血清酶。ALT和AST是主要存在于肝细胞中，当肝细胞受到损伤后被释放到血液当中。有研究表明，血液中AST活性与奶牛乳房炎的发生呈正相关，可作为预测奶牛发病的指标[11]。ALP的活性变化与炎症的程度是正相关的，可作为奶牛隐性乳房炎的早期诊断。GGT活性与谷胱甘肽的代谢有着密切关系，可反映肝脏脂肪变性的情况。患病奶牛血清中的葡萄糖含量显著升高，说明奶牛隐性乳房炎引起了糖代谢异常，这可能与泌乳时期奶牛对能量的大量需求有关。体内的胆固醇主要以转化为胆汁酸的形式存在，总胆固醇的升高与血清中的胆红素和总脂浓度有显著相关性，因此胆红素可作为评价肝代谢和损伤程度的指标。患病奶牛的总胆固醇升高可能与甘油三酯的生成和脂肪动员有关。血清中的胆红素与肝脏中的总脂含量呈正相关，因此总胆红素也可作为评价肝脏损伤程度的指标。我们的结果表明，隐性乳房炎可提高血清酶的活性，也可导致血清中的TBIL、DBIL和IDBIL的明显升高，但中药与抗生素治疗对肝代谢和肝损伤的影响无明显差异。

乳蛋白含量的升高可能与乳腺上皮细胞被破坏和分泌细胞结构疏松有关，这使血液中大量的蛋白质进入乳汁当中，从而引起乳汁中的蛋白含量升高。血乳屏障的破坏往往使乳汁中的电导率增加，从而使柠檬酸和乳糖含量下降。有研究表明，在乳房炎感染期间，牛奶中的蛋白质水解酶会破坏乳脂球膜并导致乳脂蛋白和脂肪酶脂肪变性，进而引起乳脂浓度的降低[12]。乳酶的活性一定程度可以反映奶牛乳房炎的程度，乳房炎发生后会增加NAG、MPO、ALP和LDH等乳酶的生物活性。我们的结果表明，奶牛隐性乳房炎可导致乳酶活性显著升高，这与前人的研究结果是一致的[13]。我们的研究结果发现，两种方案治疗乳品质均有改善作用，中药组治疗6 d后对乳品质恢复和治疗3 d后对乳酶活性恢复具有更好效果。

综上所述，双丁注射液和鱼腥草注射液联合应用在治愈率、产奶量、体细胞数、乳品质和乳酶活性均优于抗生素组，对奶牛隐性乳房炎有更好的治疗效果。