除草剂和种衣剂对东北森林土壤微生物群落功能的影响1)

许博涛 王璐 田蓓 李媛媛 孙广玉

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

我国平均每年农药施用面积达1.5亿hm2[1-2]，实际上只有10%发挥作用，其余农药直接进入土壤[3]，极易对农田、森林生态及水体造成污染[4-6]；此外，在人工林的管理和维护中，农药也因其成本低、效果好等优点被广泛使用[7-8]；所以其环境行为日益受到人们的关注。微生物，是森林土壤的重要组成部分，对增加土壤肥力和维持土壤养分循环等具有重要意义[9-10]，还可以促进农药等有机污染物在土壤中的降解[11]。土壤微生物活性能够及时准确地显示出土壤生态系统的微观变化，反映土壤肥力和土壤的健康状况[12]。因此，农药在进入土壤环境后，对土壤微生物群落结构及功能的影响已成为评价其生态安全的重要指标[13]。

目前，除草剂是使用量最大的农药[14]。其中，乙草胺(2-乙基-6-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代乙酰替苯胺)、莠去津(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪)是当前使用比较广泛的除草剂，大量应用于玉米、大豆、棉花等作物的田间除草[15-16]。除草剂的大量施用，在给农业生产带来效益的同时，也给生态环境带来一系列的影响。农田中喷施的除草剂，通过直接和间接的方式进入土壤，对土壤微生物数量、多样性、生态特征等产生影响[17]。已有研究表明，高浓度的乙草胺和莠去津会降低土壤脲酶活性[18]，乙草胺-Cu2+的复合污染虽然可明显促进土壤呼吸的增强，但会显著抑制细菌和真菌的丰度以及土壤脱氢酶的活性[19]；莠去津在土壤中半衰期很长，会引起作物轮作障碍，导致土壤微生物氧化损伤，引起土壤微生物群落多样性降低[20]。除草剂还会使森林土壤的肥力和土壤酶活性显著下降[21]，并且会对森林土壤微生物群落结构和功能产生明显影响[22]。

种衣剂，可以有效提升种子质量、提高作物幼苗抗病性，防治土传虫害、病害，促进作物健康生长，提高作物产量[23-24]。种衣剂在世界各地广泛使用，但是过量使用种衣剂也会对环境造成一定的影响。已有研究表明，甲霜灵种衣剂因其良好的水溶性会导致其渗透到土壤中，通过雨水和灌溉冲刷产生潜在的毒性[25]；Sukul et al.[26-27]研究发现，甲霜灵会刺激硫代硫酸盐和氮分解的相关细菌以及溶磷细菌的生长，刺激放线菌的生长并且抑制真菌，而且会导致微生物数量的急剧减少，并且会抑制土壤酶活性和土壤固氮菌和细菌总数。

以往人们关注的主要是除草剂的除草效果、种衣剂对作物生长及产量的影响，而有关两者混合施用对土壤微生物功能多样性的影响研究较少。目前，化学农药的施用对土壤微生物及其活性的影响，已成为评价农药生态安全的重要指标之一。为此，本研究于2020年8月份，在试验地——哈尔滨市城市林业示范基地选取3块样地，分别采集0～20 cm土层的非根际土土样。选用乙草胺-莠去津除草剂、精甲霜灵咯菌腈种衣剂，设置7个试验组，分别对采集的土样进行喷施处理。在设计的培养时间内，测算香农多样性指数(Shannon index)、辛普森多样性指数(Simpson index)、均匀度指数(McIntosh index)；应用Biolog-Eco微平板培养技术、单因素方差分析、主成分分析、相似百分比分析等方法，分析除草剂、种衣剂以及二者混合施用对东北森林土壤微生物群落代谢特征的影响。旨在为除草剂、种衣剂的科学使用及风险管理提供参考，为森林土壤的保护和修复提供技术支撑。

1 研究地概况

本研究地点为哈尔滨市城市林业示范基地，位于黑龙江省南部的哈尔滨市中心(44°4′～46°40′N，125°42′～130°10′E)，海拔136～140 m，区域面积48.83 hm2，土壤类型为黑土。该地区为温带大陆性季风气候，年平均气温3.6 ℃，年平均降水量569.1 mm；7月份最高气温达38 ℃，降水量占全年的60%～70%。秋季降雨明显减少，昼夜温差变幅较大。低温时间漫长而寒冷干燥，1月份最低气温达-37.7 ℃。

2 材料与方法

2.1 试验设计与样品采集处理

于2020年8月份在研究地选取3块样地，每块样地随机设置3个5 m×5 m的样方，每个样方按对角线法选取5个样点，分别采集0～20 cm土层的非根际土土样。每5个样点的土壤混合均匀，得到3个平行样，过0.425 mm筛后，带回实验室。

将土样分装在灭菌过的塑料花盆中。除草剂选用东北常用的除草剂——乙草胺-莠去津；种衣剂选用精甲霜灵咯菌腈，是用于防治真菌引起的多种土传和种传病害；除草剂、种衣剂均购于黑龙江省哈尔滨市农药商店。试验设置7个试验组：①未添加种衣剂和除草剂的对照组(CK)，②添加质量分数为5 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂(AA1)，③添加质量分数为10 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂(AA2)，④添加质量分数为0.5 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈种衣剂(SCA1)，⑤添加1.0 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈种衣剂(SCA2)，⑥质量分数为5 mg/kg的乙草胺-莠去津+质量分数为0.5 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈的混合施用(M1)，⑦质量分数为10 mg/kg乙草胺-莠去津+质量分数为1.0 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈的混合施用(M2)。分别对采集的土样进行喷施处理，每种处理设置3个重复，在25 ℃避光培养10 d，每隔2 d向样品中加入去离子水，以补偿培养期间蒸发的水分损失；培养完毕后收集所有土样进行后续测定。

2.2 土壤微生物群落功能测定

利用Biolog-Eco微平板培养技术分析土壤微生物对碳源利用的差异。步骤：将相当于10 g干土壤的新鲜土壤样品放入150 mL三角瓶中，加入100 mL无菌水，在250 r/min的摇床上摇30 min后静置15 min。在超净工作台上将悬浮液连续稀释，得到10-3土悬液。将生态板(ECO板)预热到25 ℃，用八道枪吸取150 μL的提取液至各孔中，对照孔加入150 μL的无菌水。接种后，将生态板置于培养箱中连续培养10 d(25 ℃)，每24 h测量1次吸光值(波长590 nm)。

2.3 土壤理化性质测定

通过土壤学实验方法测定土壤的理化性质[28]。采用V(水)∶m(土)为25mL∶10g，使用电位法测定土壤pH；通过重铬酸钾外加热法测定土壤有机质质量分数；通过碱解扩散法测定土壤碱解氮质量分数；通过高氯酸-硫酸法测定土壤全磷质量分数；通过钼锑抗比色法测定土壤速效磷质量分数；通过火焰光度计法测定土壤速效钾质量分数。

2.4 数据处理

平均颜色变化率(DAWC)反映了微生物群落的整体代谢活动[29]，可用于计算多种多样性指数。使用培养96 h测量的数据用于计算香农多样性指数(Shannon index，H)、辛普森多样性指数(Simpson index，D)、均匀度指数(McIntosh index，U)，评估微生物的丰富度、优势度、群落物种均匀度[30]，计算公式：

DAWC=∑[(Ci-R)/31]；

H=-∑[pi(lnpi)]；

D=∑{[ni(ni-1)]/[N(N-1)]}；

式中：Ci为31个碳孔中的波长590 nm的吸光度值；R为对照孔中的波长590 nm的吸光度值；Pi为第i孔中的波长590 nm的吸光度值除以31个孔的平均波长590 nm的吸光度值；ni为第i孔中的相对波长590 nm的吸光度值(C-R)；N为31个孔的波长590 nm的吸光度值之和。

通过Microsoft Excel 2019软件对试验数据统计处理；通过SPSS 28.0软件进行单因素方差分析；通过Origin 2021软件进行主成分分析；采用相似性百分比(SIMPER)分析计算碳源对不同处理与对照间的差异贡献率；采用皮尔逊(Pearson)相关性分析对土壤理化性质与微生物碳源利用的相关性进行研究；采用Origin 2021和R 4.1.1中的GGplot2包进行图片绘制。

3 结果与分析

3.1 土壤微生物利用碳源的动力性特征和微生物多样性变化

通过检测生态板上31种碳源的平均颜色变化率(见表1)可见：除SCA1、M1处理外，其他处理随着培养时间的延长，在0～240 h微生物利用碳源的总量呈逐渐增加的趋势，不同处理时微生物群落平均颜色变化率增长趋势不同。对照组(CK)在培养72 h增长速度变慢，在培养168 h趋于平缓；AA1、AA2、SCA1、M2处理，在培养96 h增长速度变慢，但直到培养结束均呈现增长趋势；SCA2在培养96 h后增长速度变慢，培养216 h后趋于平缓；M1在培养96 h后增长速度变慢，培养192 h后平均颜色变化率开始下降。在培养期，除AA2处理外，所有处理的平均颜色变化率均低于CK。在培养240 h，AA2的平均颜色变化率比CK增加了6.47%。

表1 在培养时间内不同处理的土壤微生物群落碳源平均颜色变化率

由表2可见：与CK相比，AA2、M2的香农多样性指数变化不显著，但AA1、SCA1、SCA2、M1的香农多样性指数显著降低(P<0.05)；与CK相比，除M1的辛普森多样性指数显著增加(P<0.05)，其余处理无显著差异；与CK相比，AA2的均匀度指数显著增加(P<0.05)，其余处理的均匀度指数均显著降低(P<0.05)。其中，AA2、M2的均匀度指数，分别高于AA1、M1的，差异显著(P<0.05)。

表2 培养96h的不同处理的土壤微生物群落香农多样性指数、辛普森多样性指数和均匀度指数

3.2 土壤微生物对碳源利用的主成分分析

由图1可见：主成分1坐标轴方向，AA2、SCA2、M2分布在0以上，AA1、SCA1、M1分布在0以下，说明农药施用对土壤微生物碳源利用的影响存在显著差异(P<0.05)；在主成分2坐标轴方向，M1、M2分布在0以上，CK、AA1、AA2分布在0以下，说明除草剂和种衣剂的混合施用、单独施用除草剂均对土壤微生物碳源利用的影响存在显著差异(P<0.05)。SCA1、SCA2、M2的点与CK距离较近，AA1、AA2、M1的点与CK距离较远，说明除草剂对土壤微生物碳源利用的影响显著大于种衣剂。总体而言，主成分1、主成分2基本上能够区分不同处理间土壤微生物群落的代谢特征。

CK为未添加种衣剂和除草剂的对照组，AA1为添加质量分数为5 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂，AA2为添加质量分数为10 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂，SCA1为添加质量分数为0.5 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈种衣剂，SCA2为添加质量分数为1.0 mg/kg的精甲霜灵咯菌腈种衣剂，M1为质量分数为5 mg/kg的乙草胺-莠去津精+质量分数为0.5 mg/kg的甲霜灵咯菌腈混合施用，M2为质量分数为10 mg/kg的乙草胺-莠去津+质量分数为1.0 mg/kg的甲霜灵咯菌腈混合施用。

由表3可见：与主成分1显著相关的碳源共有9种，分别属于碳水化合物类(2种)、羧酸类(3种)、氨基酸类(2种)、聚合物类(1种)、双亲化合物类(1种)，说明有9种碳源使不同处理间土壤微生物群落代谢功能多样性在主成分1上差异显著。与主成分2显著相关的碳源共有7种，碳水化合物类(2种)、羧酸类(2种)、氨基酸类(1种)、双亲化合物类(1种)、胺类(1种)，说明有7种碳源使不同处理间土壤微生物群落代谢功能多样性在主成分2上差异显著。

表3 不同处理中31种单一碳源与主成分1和主成分2的相关系数

3.3 土壤微生物对6种碳源的利用

在比较每个处理的平均颜色变化率分布比例之后，可以看出所有处理中的微生物群落都能够利用6个底物组(见表4)。各处理羧酸类碳源的利用率均为最高。与CK相比，AA1、AA2、SCA1、M1、M2对羧酸类碳源的利用率显著降低；施用种衣剂的处理显著高于除草剂、混合施用的处理；高质量分数的处理显著高于低质量分数的处理。与CK相比，AA2对碳水化合物类碳源的利用率显著增加，其他处理均显著降低；施用除草剂的处理显著高于种衣剂、混合施用的处理；高质量分数的除草剂处理显著高于低质量分数的除草剂处理；高质量分数的种衣剂处理显著低于低质量分数的种衣剂处理。与CK相比，SCA1对氨基酸类碳源的利用率显著降低，AA1、SCA2、M1、M2对氨基酸类碳源的利用率显著增加；施用除草剂和种衣剂混合施用处理，显著高于除草剂、种衣剂处理；高质量分数的除草剂处理显著低于低质量分数的除草剂处理，高质量分数的种衣剂处理、高质量分数的混合施用处理显著高于低质量分数的种衣剂处理、低质量分数的混合施用处理。与CK相比，所有处理对聚合物类碳源的利用率均显著增加；高质量分数的除草剂处理显著高于低质量分数的除草剂处理。与CK相比，AA1、M1对双亲化合物类碳源的利用率显著增加，SCA1、SCA2、M2对双亲化合物类碳源的利用率显著降低；施用种衣剂的处理显著低于施用除草剂的处理；高质量分数的除草剂处理显著低于低质量分数的除草剂处理，低质量分数的除草剂和种衣剂混合施用处理显著高于高质量分数的除草剂和种衣剂混合施用处理。与CK相比，SCA2、M1对胺类碳源的利用率均显著增加。

表4 不同处理时6种碳源的利用率

3.4 单一碳源利用率的变化

通过相似百分比分析，确定了对对照组与各处理组间微生物群落差异贡献率最大的3种碳源(见表5)，说明不同的处理对这些碳源的利用产生了较大的影响。与对照相比：低质量分数的除草剂施用，主要影响D-葡糖胺酸、甘氨酰-L-谷氨酸、I-赤藻糖醇等碳源的利用；高质量分数的除草剂施用，主要影响D-葡糖胺酸、衣康酸、D-半乳糖醛酸等碳源的利用；低质量分数的种衣剂施用，主要影响D-甘露醇、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸等碳源的利用；高质量分数的种衣剂施用，主要影响D-苹果酸、D-葡糖胺酸、D-半乳糖醛酸等碳源的利用；低质量分数的混合施用，主要影响I-赤藻糖醇、D-半乳糖醛酸、α-丁酮酸等碳源的利用；高质量分数的混合施用，主要影响I-赤藻糖醇、D-半乳糖醛酸、甘氨酰-L-谷氨酸等碳源的利用。

表5 单一碳源对对照组与处理组间微生物的差异贡献率

3.5 碳源利用与土壤性质的相关性

与对照组相比(见表6)：各处理中土壤pH值、土壤全磷质量分数无显著变化；AA1、SCA1中，土壤速效磷质量分数显著减少；所有处理组中，速效钾质量分数均显著增加；M2中，土壤碱解氮质量分数显著增加；AA2、M1中，土壤有机质质量分数显著增加；AA1、SCA2中，土壤有机质质量分数显著显著减少。

表6 不同处理的土壤理化性质

利用皮尔逊相关性分析不同处理时碳源利用率与土壤化学性质之间的相关性(见表7)。结果表明：碳水化合物类碳源，与羧酸类碳源、双亲化合物类碳源呈显著正相关(P<0.05)，与胺类碳源呈极显著负相关(P<0.01)；羧酸类碳源与胺类碳源呈显著负相关(P<0.05)；双亲化合物类碳源与胺类碳源呈显著负相关(P<0.05)。碳水化合物类碳源与土壤有机质质量分数呈显著负相关(P<0.05)；羧酸类碳源与土壤速效磷质量分数呈显著正相关(P<0.05)；氨基酸类碳源，与土壤全磷、土壤碱解氮质量分数呈显著正相关(P<0.05)，与土壤有机质质量分数呈显著负相关(P<0.05)；双亲化合物类碳源与土壤pH、土壤碱解氮质量分数呈显著负相关(P<0.05)；聚合物类碳源与土壤速效钾质量分数呈显著正相关(P<0.05)；胺类碳源与土壤速效磷质量分数呈显著负相关(P<0.05)。

表7 碳源利用与土壤性质的相关系数

4 讨论

利用Biolog-Eco微平板培养技术研究土壤微生物群落的多样性，可以反映出土壤微生物的生态功能。平均颜色变化率不但能反映出土壤微生物群落代谢活性，而且能体现出土壤微生物对单一碳源的利用强度[31]。本研究表明，施用质量分数为10 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂后平均颜色变化率增加，其他处理中的平均颜色变化率均低于对照；施用质量分数为5 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂、施用种衣剂，均会使平均颜色变化率显著降低，说明种衣剂、质量分数为5 mg/kg的除草剂会对森林土壤微生物群落的碳源代谢产生一定的抑制作用。其中，施用M1对土壤微生物群落的碳源代谢产生的抑制作用最强，而施用M2抑制显著减轻，这与施用质量分数为10 mg/kg的乙草胺-莠去津除草剂对土壤微生物群落碳源代谢有明显促进作用有关。已有研究表明，施用农药的初期土壤微生物群落对进入到土壤中的农药具有一定的耐受性，并且一些微生物会利用农药为碳源进行分解作用，这会导致微生物进行繁殖[32]。张金鹏等[33]研究发现，施用高质量分数的莠去津除草剂，能显著增加土壤微生物的种群数量。莠去津除草剂可以对土壤中的细菌和真菌产生促进作用，而对放线菌无影响或产生一定的促进[34-36]。施用不同浓度肟菌酯后，土壤微生物群落的演变趋势差异也较大[37]，这种结果说明土壤微生物群落对除草剂的刺激比较敏感，除草剂对土壤微生物群落产生了较大的影响。

进一步评价除草剂和种衣剂对森林土壤微生物多样性、丰富度及均匀度的影响。结果表明，施用质量分数为10 mg/kg的除草剂、施用M2的，香农多样性指数变化不显著，其余处理的香农多样性指数均显著降低。已有研究表明，农药污染后土壤微生物群落多样性指数显著降低[38]，主要原因是由于受农药污染后，土壤微生物群落中利用碳源的微生物物种的均一程度受到显著影响。与对照相比，施用M1的辛普森指数显著增加，说明农药进入土壤后会造成土壤微生物群落功能发生变化，适量的农药处理将使得土壤中原有的微生物群落内部种群间的竞争关系发生变化，原有的平衡遭到破坏，优势类群发生改变[39]。总体而言，除施用质量分数为10 mg/kg的除草剂外，其余处理的均匀度指数均显著降低，说明农药作为土壤微生物群落的外来干扰因素，会使某些微生物菌种的生长受到抑制，最终导致土壤微生物群落均匀度发生改变[40]。郑丽萍等[41]的研究表明，随着有机氯浓度的增加，有机氯污染对微生物活性的抑制作用增强，降低微生物的多样性。

主成分分析结果表明，除草剂、混合施用处理，微生物群落功能多样性与对照差异显著，其中与主成分1显著相关的碳源有9种，主要为碳水化合物类碳源、羧酸类碳源、氨基酸类碳源、聚合物类碳源、双亲化合物类碳源；与主成分2显著相关的碳源有7种，主要为碳水化合物类碳源、羧酸类碳源、氨基酸类碳源、双亲化合物类碳源、胺类碳源。由此可知，对除草剂的处理比较敏感的碳源类型为碳水化合物类碳源、羧酸类碳源、氨基酸类碳源、聚合物类碳源、双亲化合物类碳源，对混合施用处理比较敏感的碳源类型为碳水化合物类碳源、羧酸类碳源、氨基酸类碳源、双亲化合物类碳源、胺类碳源。比较每种处理的碳源利用率之后可以看出，各处理对于6种碳源的利用呈现出差异，通过相似百分比分析得到的结果也显示，造成不同处理碳源利用变化的碳源种类也存在差异，说明无论是除草剂还是种衣剂均会改变土壤微生物对碳源的利用情况，这与之前的研究结果一致[3，42]。之前的研究表明，农药的施用会改变土壤的理化性质[43-44]，本研究结果表明，除草剂和种衣剂的施用会改变土壤的化学性质。环境因子的变化会导致土壤微生物群落结构、多样性及功能发生改变。Fierer et al.[45]的研究发现，土壤碳和氮含量是调控微生物群落结构的主要因子。本研究利用皮尔逊相关性分析发现，碳源利用率与土壤化学性质显著相关，说明农药处理后土壤化学性质的改变是导致土壤微生物对6个碳源的利用产生影响的原因之一。

5 结论

使用Biolog-Eco微平板培养技术研究乙草胺-莠去津除草剂和精甲霜灵咯菌腈种衣剂对东北森林土壤微生物的影响表明：①低质量分数的除草剂和种衣剂以及二者混合的处理，一定程度地降低了微生物的活性，高质量分数的乙草胺-莠去津除草剂可以增加微生物活性；②不同处理的碳源利用方式均不同，森林土壤微生物会根据环境变化的不同改变自己的碳源利用策略；③土壤理化性质也是影响土壤微生物利用6碳基团的因素之一。综上所述，除草剂和种衣剂都改变了土壤微生物群落功能，不同质量分数的除草剂和种衣剂，对土壤微生物群落功能的影响不同。农药污染会对森林土壤生态系统的稳定性造成危害，增加生态系统被破坏的风险。未来会针对森林土壤微生物应对农药污染的群落结构多样性和遗传多样性的改变进行深入研究，为农药污染的修复以及土壤资源的保护提供前期研究。