Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对木槿种子萌发及抗氧化特性的影响1)

孙颖 孟儒 苗林琦 高东菊 张凤娥

( 东北林业大学，哈尔滨，150040)( 上海农林职业技术学院)

近年来土壤污染问题日益严重。自然界中的一些重金属离子难以被微生物分解掉，存留下来会对植物生长造成严重危害。因此重金属污染作为土壤污染中较为严重的问题备受人们关注。铜、锌是植物体所必需的微量营养元素，广泛参与植物体内的多种生理生化代谢过程[1]，对植物发育和机体代谢有重要作用。但是，铜积累过量，植物体会产生大量的自由基和丙二醛，使离子平衡遭到破坏，引起生理反应紊乱，进而导致铜毒害[2]；锌过量则会抑制光合作用，造成植物缺铁性失绿等问题，影响植物正常的生长发育[3]。据统计，全球每年释放到环境中的铜、锌高达14.7、27.6万t[4]，如果形成更复杂的重金属复合污染，通过相加、拮抗、协同、独立作用等[5]，会大大增加重金属污染的治理难度，严重影响人们正常的生产生活以及生态环境质量。

种子萌发和幼苗生长是植物对外界环境适应的开始，该时期也是植物对外界环境条件反应最敏感的时期。研究重金属污染对萌发期种子的影响可以筛选重金属超富集植物，监测土壤环境污染情况，为重金属污染的环境治理构建植物资源库[6-8]。木槿(HibiscussyriacusL.)是锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)的落叶灌木，夏秋开花，朝开暮谢，花大，有淡紫、红、白等多种颜色，单瓣或重瓣等品种，适宜庭园观赏[9]。木槿对土壤的要求不高，较耐贫瘠及干旱，对SO2和氯化物等有害气体有极强抗性。木槿还有很强的滞尘能力，是治理污染环境的优选绿化树种。目前有关木槿的研究主要集中在栽培技术[10-11]、亲缘关系[12]、物质合成[13]等方面，关于其抗重金属污染能力方面的报道尚未发现。本研究旨在通过研究铜单一胁迫、锌单一胁迫、铜锌复合胁迫在木槿种子发育阶段对其发芽指标、生长指标、生理指标的影响，探讨木槿种子对3种胁迫的适应能力及范围，为重金属污染土壤修复的植物筛选和扩大木槿的园林绿化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成熟的木槿种子于2019年10月采于上海农林职业技术学院院内。挑选长势一致、种粒饱满、无病虫害的种子取出后晾干。试验前先将种子用去离子水浸泡24 h，后用质量分数为0.4%高锰酸钾溶液浸泡1 h，最后用去离子水冲洗5次，用于胁迫试验。

1.2 试验方法

Cu2+溶液以分析纯的CuSO4·5H2O配制，Zn2+溶液以分析纯的ZnSO4·7H2O配制。根据预试验结果，试验设置Cu2+单一胁迫(50、100、150、200、250、300 mg·L-1)、Zn2+单一胁迫(50、100、150、200、250、300 mg·L-1)、，Cu2+/Zn2+复合胁迫(50/50、100/100、150/150、200/200、250/250、300/300 mg·L-1)3组处理，以等量的去离子水处理作为对照(CK，表1)。采用纸上发芽法进行种子萌发胁迫试验。分别向每个培养皿中加入等量的不同质量浓度处理液将滤纸浸至饱和，除处理液不同外其他因素保持一致。培养条件为温度25 ℃，空气相对湿度75%，光照14 h·d-1、光强6 000 lx。萌发培养期间根据实际情况增加相应的处理液，使滤纸始终保持湿润状态。每日定时观察种子的萌发情况。每个处理30粒种子，3个重复。

1.3 指标测定

1.3.1 发芽指标的测定

以种子胚根露白作为发芽标准，统计各试验组种子的发芽指标[14]。

发芽率=(发芽试验终期(8 d)正常发芽种子粒数/试验种子总粒数)×100%；

发芽势=(发芽试验初期(5 d内)正常发芽种子粒数/试验种子总粒数)×100%；

发芽指数(Gi)=∑Gt/Dt。

式中：Dt为发芽时间；Gt为与Dt相对应的每天的发芽种子数。

相对发芽率=(处理种子发芽率/对照种子发芽率)×100%。

种子耐重金属胁迫的半致死质量浓度为种子发芽率达到相对发芽率的50%时重金属溶液质量浓度；种子耐重金属胁迫的极限质量浓度为种子发芽率达到相对发芽率的10%时重金属溶液质量浓度。

表1 铜、锌单一及铜锌复合胁迫的试验设计

1.3.2 形态指标的测定

发芽试验结束后，依次在已经发芽的各处理中随机选取10株幼苗，用游标卡尺测量幼苗的胚根长度。

1.3.3 生理指标的测定

取0.2 g幼苗，放置于5 mL的离心管后在球磨机内研磨成匀浆，加入4 mL的0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸缓冲液于离心管中，于4 ℃下10 000 r·min-1冷冻离心20 min，取上清液立即放入4 ℃冰箱储存待测。丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性的测量参考王学奎[15]的测量方法。

1.3.4 耐铜锌能力评价

采用模糊数学中隶属函数值的方法进行抗逆性综合评定[16]。

R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。

式中：Xij为第j个材料第i项综合指标的值；Xjmax为各处理的最大测定值；Xjmin为各处理的最小测定值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件进行试验数据的统计，SPSS 22.0检验样本间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 铜锌单一及复合胁迫对木槿种子发芽能力的影响

由表2可知，随着铜、锌单一及铜锌复合胁迫质量浓度的提高，木槿种子的发芽率呈现先上升后下降的趋势。其中，在质量浓度为50 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，3种胁迫处理的发芽率均显著高于CK(P<0.05)，表明低质量浓度的铜、锌单一及铜锌复合胁迫在一定程度上促进了木槿种子的萌发。在质量浓度不低于100 mg·L-1的铜、锌单一及铜锌复合胁迫时，木槿种子的发芽率呈现不同程度的下降。铜单一胁迫质量浓度为100、150、200、250、300 mg·L-1时，木槿种子发芽率分别降低了25.59%、48.83%、90.69%、97.67%、100.00%；锌单一胁迫质量浓度为100、150、200、250、300 mg·L-1时，木槿种子发芽率分别降低了30.24%、41.09%、58.14%、84.50%、98.45%；铜锌复合胁迫质量浓度为100/100、150/150、200/200、250/250、300/300 mg·L-1时，木槿种子发芽率分别降低了27.17%、50.40%、78.29%、90.69%、98.45%。综合比较，在质量浓度为250 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，木槿种子发芽率极低；在质量浓度为300 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，木槿种子发芽率几乎为0。

表2 铜、锌单一及复合胁迫下木槿种子的萌发情况

木槿种子发芽势的变化趋势和发芽率基本一致，即随着胁迫质量浓度的升高先升后降(表2)。在质量浓度为50 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，木槿种子的发芽势均高于CK，其中铜单一胁迫时发芽势最高，为70.00%，铜锌复合胁迫时发芽势最低，为65.33%。在质量浓度高于50 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，随着溶液质量浓度的提高，发芽势依次下降。在质量浓度为200 mg·L-1的铜单一胁迫时，发芽势降低至5.00%，在质量浓度为250 mg·L-1的锌单一及铜锌复合胁迫时，发芽势分别降至6.67%、1.11%。在质量浓度为300 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，发芽势均为0。

在质量浓度为50 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，3种胁迫对木槿种子的发芽指数均具有一定的促进作用。随着处理液质量浓度的提高，3种胁迫下的发芽指数均呈现不同程度的下降趋势(表2)。

由表3可知，3种胁迫的处理液质量浓度与木槿种子相对发芽率之间呈显著负相关。根据回归方程预测，铜单一胁迫时的半致死质量浓度、极限质量浓度最低，分别为159.88、242.13 mg·L-1；锌单一胁迫时的半致死质量浓度、极限质量浓度最高，分别为174.69、270.57 mg·L-1；铜锌复合胁迫时的半致死质量浓度、极限质量浓度居于两者之间。

表3 Cu2+、Zn2+质量浓度与木槿种子相对萌发率的相关性

2.2 铜锌单一及复合胁迫对木槿种子胚根的影响

由表4可知，铜、锌单一及复合胁迫对木槿种子的胚根生长具有抑制作用。胁迫处理液质量浓度越高，对胚根的抑制作用越强。其中，在质量浓度为50 mg·L-1的铜单一胁迫时，该胁迫显著抑制了木槿胚根的生长；在质量浓度为100 mg·L-1的锌单一及铜锌复合胁迫时，这2种胁迫才对木槿胚根的生长产生显著的抑制作用。在质量浓度为100、150、200 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，各处理组间的胚根长度均呈显著差异(P<0.05)。在质量浓度为250、300 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，胚根生长受到极其严重的抑制。

2.3 铜锌单一及复合胁迫对木槿幼苗MDA质量摩尔浓度的影响

如表5所示，随着3种胁迫质量浓度的提高，木槿幼苗的MDA质量摩尔浓度呈逐渐上升的趋势。在质量浓度为50 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，MDA质量摩尔浓度与CK之间无显著差异(P>0.05)；在质量浓度为50～250 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，各处理组间MDA质量摩尔浓度均呈显著差异(P<0.05)。在质量浓度为300 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，MDA质量摩尔浓度分别是CK的2.95、2.75、2.83倍。总体来看，在相同质量浓度胁迫条件下，铜单一胁迫对木槿幼苗MDA质量摩尔浓度的影响大于锌单一胁迫。

表4 不同胁迫处理对木槿种子胚根的影响

表5 不同胁迫处理对木槿幼苗MDA质量摩尔浓度的影响

2.4 铜锌单一及复合胁迫对木槿幼苗POD、SOD活性的影响

由表6可知，木槿幼苗的POD活性随着胁迫质量浓度的提高呈先升后降的趋势。铜单一胁迫条件下，处理液质量浓度为100 mg·L-1时POD活性达到最大值，是CK的1.24倍，与CK间差异显著(P<0.05)；锌单一胁迫时POD活性较铜单一胁迫时变化幅度小，其在处理液质量浓度为150 mg·L-1时POD活性达到最大值，是CK的1.19倍；铜锌复合胁迫下POD活性的变化趋势与铜单一胁迫类似，POD活性的高峰值也出现在处理液质量浓度为100 mg·L-1时，此时POD活性是CK的1.23倍。在处理液质量浓度为100～150 mg·L-1时，3种胁迫下木槿幼苗出现POD活性高峰值，之后POD活性显著下降；在处理液质量浓度为300 mg·L-1时，铜、锌单一及铜锌复合胁迫时的POD活性分别为CK的0.71、0.77、0.73倍。

表6 不同胁迫处理对木槿幼苗POD活性的影响

木槿幼苗的SOD活性随3种胁迫处理质量浓度的升高亦呈先升后降的趋势(表7)。铜、锌单一及铜锌复合胁迫的SOD活性高峰值分别出现在处理液质量浓度为100、50、100 mg·L-1时。除铜单一胁迫外，另2种胁迫的高峰值与CK相比差异不显著。SOD活性在小幅度上升后逐渐下降，在处理液质量浓度为200 mg·L-1时SOD活性降低十分显著，至处理液质量浓度为300 mg·L-1时，铜、锌单一胁迫及铜锌复合胁迫的SOD活性仅为CK的0.81、0.88、0.85倍。

2.5 铜锌单一及复合胁迫下木槿种子萌发和幼苗生长的抗逆性综合评定

如表8、表9、表10所示，3种胁迫处理下木槿测定指标的平均隶属函数值从大到小依次为：Zn2+单一胁迫、Cu2++Zn2+复合胁迫、Cu2+单一胁迫，表明木槿种子在萌发时期耐重金属胁迫的能力由大到小依次为耐锌单一胁迫、耐铜锌复合胁迫、耐铜单一胁迫。

表7 不同胁迫处理对木槿幼苗SOD活性的影响

表8 不同铜单一胁迫下木槿测定指标的隶属函数值

表9 不同锌单一胁迫下木槿测定指标的隶属函数值

表10 不同铜锌复合胁迫下木槿测定指标的隶属函数值

3 讨论

种子萌发是植物体生长发育的初始阶段，所以种子萌发的情况直接影响植物后期的生长发育状况。本研究发现，随着铜、锌单一胁迫及铜锌复合胁迫质量浓度的升高，木槿种子的发芽率、发芽势、发芽指数均呈先升高后降低的趋势，说明低质量浓度的3种胁迫方式均刺激了木槿种子自身的抗逆性反应，在形态学上呈现发芽率、发芽势短暂升高的现象。高质量浓度的重金属铜离子、锌离子胁迫时，植物为了在胁迫条件下维持细胞内的离子平衡，必将消耗植物体的有效能量，从而使植物的生长发育受阻[17]，这与很多研究的结果一致[18-20]。在质量浓度为100 mg·L-1的铜、锌单一及复合胁迫时，木槿种子发芽率均呈现显著下降，说明此质量浓度已经开始破坏种子的自我防御机制。处理液质量浓度为200 mg·L-1时，锌单一胁迫时仍有30.00%的发芽率，此时铜单一胁迫、铜锌复合胁迫时的发芽率仅为6.67%、15.56%。

种子萌发后，根最先突破种皮吸水，从而使根尖的重金属积累量较多，受胁迫时间较长。因此，重金属对植物根的抑制作用更显著[21-23]。从3种胁迫处理后木槿种子胚根生长的情况来看，低质量浓度(50 mg·L-1)的铜、锌单一及铜锌复合胁迫处理时即开始出现抑制胚根生长的现象，至处理液质量浓度为300 mg·L-1时，种子几乎完全致死，此时对胚根的抑制作用强烈，仅有的露白种子胚根也不再伸长，呈坏死状态。结合发芽率分析，虽然低质量浓度胁迫时木槿种子发芽率提高，但裸露的胚根对3种重金属胁迫反应更为敏感，因此在低质量浓度胁迫时即出现抑制胚根生长的现象。

植物体内抗氧化酶的活性及其正常的理化性质会在植物遭受逆境胁迫时发生一系列改变。活性氧水平的上升会产生大量的丙二醛，造成膜脂过氧化，从而阻碍植物正常生长[24]。本研究中，木槿幼苗的MDA质量摩尔浓度在处理液质量浓度为50 mg·L-1时虽有小幅度的升高，但与CK差异不显著，说明此时的细胞膜处于较稳定状态；当处理液质量浓度超过100 mg·L-1时，MDA质量摩尔浓度开始大幅上升，说明细胞代谢逐渐紊乱。SOD和POD是防止植物细胞产生活性氧簇的重要的抗氧化酶[25]，木槿幼苗的POD和SOD活性变化情况均呈现“低升高降”趋势，说明低质量浓度胁迫时木槿幼苗体内的POD和SOD活性发生了应急性地提高，以帮助幼苗清除自由氧，稳定细胞的防御系统。但当处理液质量浓度超过150 mg·L-1时，高质量浓度的重金属离子明显抑制了抗氧化酶的活性，超过了保护酶的清除范围，植物防御机制遭到严重破坏，因此二者活性急剧下降，造成一系列幼苗生长发育受阻的现象。

通过对3种重金属胁迫下3项发芽指标、1项生长指标、3项生理指标参数的隶属函数综合分析，得出木槿种子萌发和生长阶段对3种重金属胁迫的耐受能力强弱依次为：锌单一胁迫、铜锌复合胁迫、铜单一胁迫。本试验仅探讨了铜单一胁迫、锌单一胁迫、铜锌复合胁迫对木槿种子的萌发特性、幼苗生长、抗氧化特征的影响，对于木槿在3种重金属污染土壤中的生长情况、成年植株地上、地下部分产量、植物的富集转运规律及分子水平上的影响还需进一步细致、定量地探究。