益生菌发酵饲料对长白种公猪精液品质的影响

2022-05-16程泽超韩培源杨公社胡建宏

中国畜牧杂志 2022年5期

程泽超，韩培源，武丹，杨公社，胡建宏，李晓

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

益生菌发酵饲料（Fermented Feed，FF）能够有效提高饲料适口性、营养利用度、畜禽生长性能和肉品质，是理想的抗生素替代品之一。近几十年中，人工授精技术在生猪养殖中广泛应用，在降低疾病传播风险、提高优良公猪的利用率、促进优良品种选育等方面发挥了巨大作用，同时也对精液品质提出了更高要求。孙昌辉研究显示，利用益生菌发酵玉米-豆粕全价饲料，极显著提高了大白公猪精子的密度和活率，提高精液的抗氧化性能，有效改善了精液品质。Guo 等通过16S rRNA 基因测序分析了高精液利用率和低精液利用率的杜洛克公猪粪便微生物组成，发现瘤胃球菌属和鞘脂菌属与精液利用率呈负相关，并且低利用率组公猪血清白介素6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor Alpha，TNF-）等促炎因子显著提高，这提示肠道菌群可能通过调控公猪的免疫机能影响精液品质。本试验旨在探讨不同替代比例的发酵饲料对公猪生殖性能和粪便菌群的影响，从而为商业化公猪发酵饲料的推广提供试验依据，并为生态养殖和动物性食品安全提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料复合益生菌（蔚蓝生物科技有限公司）包含41.67% 枯草芽孢杆菌、25% 酵母菌、16.67% 植物乳杆菌和16.67%粪肠球菌。试验期全程使用的玉米-豆粕型种公猪基础日粮由广西金陵农牧集团提供。

1.2 试验设计及试验日粮试验在广西首牧种猪育种有限公司公猪站进行。采取单因素试验设计，选取20 头（150±20）日龄、体重（107.9±12.5）kg 的长白种公猪，随机分为5 组。以玉米-豆粕型基础日粮为底物，按照说明书以1 g/kg 的剂量接种益生菌，水分调至40%，使用单向排气发酵袋密封发酵4 d 制成发酵饲料。以发酵饲料的干物质计算，分别以5%、10%、15%、20%比例替代基础日粮（5%、10%、15%、20% FF 组）。试验日粮的常规营养成分及氨基酸组成见表1。

表1 试验日粮营养成分 %

1.3 饲养管理试验种公猪采用单栏饲养，每天分别于07:00 和17:00 各饲喂1 次，自由饮水，猪舍内温度控制在20℃左右，其他饲养管理流程和免疫流程均按照猪场中常规饲养管理进行。

1.4 血液指标测定在饲养50 d 时对公猪进行前腔静脉采血5 mL，采集到的公猪血液静置2 h 后置于4℃的离心机内3 000 r/min 离心15 min，然后吸出上层血清，做好标记后置于-20℃保存。使用全自动生化分析仪测定公猪血清的常规生化指标，由广西国际壮医医院明秀分院完成测定；公猪血清免疫球蛋白IgG、IgA 和IgM含量使用ELISA 试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）测定，每个样品2 个重复。

1.5 公猪精液采集与指标测定试验第60 天分别对试验种公猪使用手握法采精，收集公猪射精中段部分，经过2 层无菌滤纸过杂质，然后将精液置于保温瓶中送至化验室。

使用计算机自动分析（CASA）系统检测精子活率。精子活率定义为沿直线前进运动的精子数占总精子数的百分比。检测时，每组各取1 mL 精液，于1.5 mL 离心管中放入37℃水浴锅中预热10 min。检测时吸取10 μL精液样品滴于载玻片上，将载玻片放置于显微镜物镜下的恒温载物台（37℃）上预热30 s，随后用CASA 系统进行检测计算。

采用姬姆萨染色法检测精子的顶体完整率。取20 μL 待测精液于载玻片，抹片后风干，4% 甲醛固定10～15 min，用纯水冲洗，风干。用姬姆萨染色1.5～2 h，纯水冲洗2 次，风干。40 倍镜下观察，从5 个不同视野中随机检测200 个精子进行统计。若顶体及精子形态完好，顶脊清晰，顶体部分均匀一致，核后帽分明，精子尾部各段完好，记为顶体完整精子；若顶体膨胀，顶脊模糊，顶体外缘不规则，或顶体部分脱落，顶体形成缺口、脱离或翻转，或顶体完全脱离，整个精子头部呈淡蓝色，均记为顶体损伤。

采用低渗肿胀试验（Hypoosmotic Swelling Test，HOST）法检测精子质膜的完整率。取20 μL 待测精液于1.5 mL EP 管，加入200 mL 37℃预热的HOST，37℃孵育30～35 min。取混合液20 μL，抹片后风干，2.5%戊二醛固定15 min，纯水冲洗，风干，置于40 倍镜下观察。从5 个不同的视野中随机检测200 个精子，依据计数准则计数，精子质膜完整率=质膜完整精子数/总精子数。

1.6 粪便样品采集与测序在试验第60 天采集公猪新鲜粪便，离心管分装迅速置于液氮中保存，后转入-80℃冰箱保存至检测，使用16S rRNA 测序对粪菌菌群进行分析。

1.7 统计分析采用Microsoft Excel 2019 对试验数据进行初步整理，使用单因素方差分析（SPSS 21.0 软件）对数据进行统计分析。结果以平均值±标准误来表示，GraphPad Prim 6 软件作图。＜0.05 表示差异显著，＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 发酵饲料对公猪的血液生化指标和免疫球蛋白的影响如表2 所示，发酵饲料对公猪血清总蛋白、白球比、谷草/谷丙比、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等均无显著性影响。如图1所示，10% 和15% FF 组提高了血清IgG、IgM 和IgA水平（＜0.01）；5% FF 组提高了血清IgA 和IgM 水平（＜0.05）、IgG 水平（＜0.01）；20% FF 组血清IgA 水平（＜0.05）、IgG 和IgM 水平也均提高（＜0.01）。

图1 发酵饲料对公猪血清IgA（A）、IgG（B）和IgM（C）水平的影响

表2 发酵饲料对公猪的血液生化指标影响

2.2 发酵饲料对公猪精液品质的影响发酵饲料对公猪精液品质常规指标的影响如表3 所示。各试验组公猪与对照组公猪在采精量上无显著差异，但20% FF 组公猪的采精量低于15% FF 组（＜0.05）。与对照组公猪相比，5%、10%、15% FF 组精子活率与A 级精子的比例增高（＜0.05），而B 级精子和C 级精子减少（＜0.05）。10% 和15% FF 组公猪的A+B 级精子数高于对照组和20% FF 组（＜0.05）。

表3 发酵饲料对猪精液品质相关指标的影响

如图2 所示，4 个试验组公猪精子的顶体完整率均高于对照组公猪（＜0.01）；如图3 所示，与对照组相比，10%和15% FF 组提高了公猪精子的质膜完整率（＜0.01），20% FF 组也提高了公猪精子的质膜完整率（＜0.05），但与5% FF 组无显著差异。

图2 发酵饲料对猪精子顶体完整率的影响

图3 发酵饲料对猪精子质膜完整率的影响

如图4 所示，20% FF 组精浆果糖水平高于对照组（＜0.05），5%、10% 和15% FF 组公猪精浆果糖水平均高于对照组（＜0.01）。

图4 发酵饲料对猪精浆中果糖水平的影响

2.3 发酵饲料公猪粪菌菌群结构的影响由于10% 和15% FF 组精液品质较好，因此用于深入分析猪粪便菌群的组成。如图5 所示，基础日粮和2 个试验组公猪粪便菌群有9 个门类，分别是厚壁菌门、拟杆菌门、广古菌门、螺旋体门、变形菌门、放线菌门、互养菌门、柔膜菌门和酸杆菌门。由表4 可见，10% FF 组猪粪中柔膜菌门低于对照组（＜0.05），15% FF 组粪便厚壁菌门丰度降低，拟杆菌门丰度升高（＜0.05）。

表4 发酵饲料对公猪粪便菌群的影响（门水平）

图5 公猪粪便中微生物门水平的相对丰度

对公猪粪便细菌群落门和科水平的细菌丰度与精液品质指标进行相关性分析。如表5 所示，在门水平上，柔膜菌门丰度与精子活率呈负相关（=-0.64,＜0.05），精浆果糖浓度与厚壁菌门丰度呈负相关（=-0.67，＜0.05），与拟杆菌门丰度显著正相关（=0.75，＜0.05）；在科水平上，粪便芽胞杆菌科（=-0.64）丰度与精浆果糖浓度呈现负相关，而拟杆菌科（=0.75）的丰度与精浆果糖浓度均正相关（＜0.05）。

表5 公猪粪便中细菌门水平和科水平的细菌丰度与精液品质指标的相关性分析

3 讨论

3.1 发酵饲料对公猪的血液生化指标和免疫球蛋白的影响猪血液的生化指标在一定程度上可反映猪的生理和免疫状况。饲喂发酵饲料后公猪的血液生化指标与对照组没有显著差异，说明发酵饲料对公猪健康没有负面影响，这与Vadopalas 等的研究结果一致。免疫球蛋白对动物机体的免疫力具有重要作用，血清免疫球蛋白水平能够间接反映猪只对疾病的抵抗能力。发酵饲料中的益生菌在进入动物的胃肠道后会竞争性抑制病原微生物，益生菌及其代谢产物还能够通过刺激肠道中的免疫细胞，进而分泌免疫球蛋白和一些细胞因子，这些细胞因子和免疫球蛋白进入体循环后进一步刺激其他免疫器官；此外，益生菌产生的细菌素和短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）等物质也能够刺激动物免疫系统，增强机体免疫功能。本研究结果显示，4个试验组的公猪血清IgA、IgG 和IgM 水平均高于对照组，与先前的研究结果一致。综上结果表明，益生菌发酵饲料能够提高种公猪的免疫功能。

3.2 发酵饲料对公猪精液品质的影响精子活率是指在所有精子中沿直线运动精子所占的比例，只有直线运动的精子才能到达输卵管与卵子结合，所以精子活率反映了精液中的有效精子量。本试验结果表明，5%、10%和15% FF 组公猪精液中有效精子数和精子的运动性能显著升高，与杜烨青的研究结果一致。此外，5%、10%和15% FF 组公猪精液的A 级精子显著多于对照组，10% 和15% FF 组A+B 级精子数量显著增加，表明发酵饲料有效提高了公猪精子活率，并改善了精子的运动性能。

精子顶体位于精子头的顶部。在顶体反应过程中，只有形态完整、功能正常的顶体才能帮助精子穿过透明带与卵子结合，因此精子顶体完整率是衡量精子成功穿透透明带的重要参数。在本研究中，5%、10%、15%及20% FF 组公猪的精子顶体完整率极显著高于对照组，说明发酵饲料对公猪精子顶体形态有促进作用，有利于精卵结合。对于精子来说，质膜在外界有害物质侵害时保护精子的重要屏障。本试验结果表明，10%和15% FF 组公猪精子的质膜完整率较对照组均极显著提高，20% FF 组公猪精子的质膜完整率显著提高，表明发酵饲料能够提高公猪精子质膜的完整率，从而提高精子质量。

公猪精浆为精子提供能量，其中果糖是主要的能量来源。果糖能够维持精子的正常功能，尤其是确保精子具有足够的运动性。精浆中果糖水平与男性精子的质量密切相关。也有研究结果表明，在公猪精液稀释剂中添加果糖能够延长精液在4℃下的保存时间，并且显著提高精子质量。本研究结果显示，5%、10%和15% FF 组公猪精浆果糖水平极显著高于对照组公猪，20% FF 组精浆果糖水平显著高于对照组，这与饲喂发酵饲料后较高的精子活率一致。本研究表明，发酵饲料能够有效增加精浆中的精子能量物质，有利于精子保存和后续的人工授精。

3.3 发酵饲料对公猪粪菌菌群结构的影响本研究中厚壁菌门和拟杆菌门是猪粪便细菌群落中的两个优势菌，这与前人的研究结果一致。在杜洛克公猪的研究中发现，精液利用率与粪便厚壁菌门的丰度负相关，与拟杆菌门的丰度显著正相关，提示粪便菌群组成可能影响精液品质。众所周知，雄性动物的肥胖不利于精子的产生和成熟，同时厚壁菌门/拟杆菌门的比值随着动物肥胖程度的增加而增加，这从侧面也印证了肠道菌群与精子质量有关。本研究中，15% FF 组公猪粪便中厚壁菌门丰度显著下降，拟杆菌门丰度显著增高，发酵饲料降低了厚壁菌门/拟杆菌门的比值。因此，推测发酵饲料提高精液品质可能与改善肠道微生物群落有关。

进一步相关性分析显示，公猪精子活率与粪便柔膜菌门丰度显著负相关，精浆果糖浓度与粪便中厚壁菌门、芽胞杆菌丰度显著负相关，与拟杆菌门、拟杆菌科丰度显著正相关。目前，尚未有肠道或粪便微生物菌群影响精浆代谢物的相关报道，但从已有的资料来看，饮食中的果糖可以改变肠道菌群组成及代谢，因此推断果糖代谢与肠道菌群之间应该存在某种联系，发酵饲料可能通过改变肠道微生物组成，从而改变精浆中果糖浓度，进而影响精子活率和精液品质，但具体互作机制有待进一步研究。