Myf5 基因在不同时期绵羊胎儿半腱肌和背最长肌中的表达及生物信息学分析

2022-05-16窦敏敏赵迪鹏王鹤洁郭田燕李俊玲王聪慧李颖靓

中国畜牧杂志 2022年5期

窦敏敏，赵迪鹏，王鹤洁，郭田燕，李俊玲，李君，王聪慧，秦健,2，李颖靓，杜荣*

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学实验教学中心，山西太谷 030801）

骨骼肌主要由成束状排列的骨骼肌纤维构成，包括肌浆网、横小管和肌原纤维，其不仅为动物组织的葡萄糖氧化和脂肪酸氧化提供重要场所，而且也为哺乳动物的产热和运动提供保障。在畜禽体内，骨骼肌发育是否良好还是决定肉产量和肉品质的主要因素。骨骼肌的形成发展过程是一个循序渐进、极其复杂的微观生物学过程，包括胚胎期和幼年期的肌肉发育以及成年骨骼肌损伤再生修复过程。胚胎期是骨骼肌发育的最关键时期，大多数肌纤维都是在胚胎期形成。肌细胞在形成及融合过程中涉及多种因子的参与，其中生肌调节因子（Myogenic Regulatory Factors,MRFs）家族对肌管分化和成肌命运决定及骨骼肌系统的发育成熟发挥着关键的作用。

肌源性因子5（Myogenic Factors 5，Myf5）是生肌调节因子MRFs 家族的重要成员，对肌细胞生成与分化及其新陈代谢等活动都具有至关重要的调节作用。基因在成肌细胞不断增殖的生长过程中迅速得到广泛表达，主要调节肌细胞的形成、再生和稳态。Myf5 和MyoD 一起充当骨骼肌分化的特异性转录因子，协同MyoD 在肌肉形成过程中发挥重要作用。Kablar等敲除小鼠的和基因后，显著抑制了其成肌细胞和肌纤维的生成能力。缺失基因的成年小鼠，骨骼肌会发生微妙的、进行性的肌病，肌纤维直径异质性增加，中央成核和纤维化增加。基因对肌肉的调控包括胎儿出生前后肌肉生长发育阶段中的调控和发育成熟肌肉受损后再生过程中的调控。目前，基因在胎儿发育过程中的功能研究主要集中在小鼠上，在绵羊中的研究相对较少。绵羊是重要的产肉经济动物，但其骨骼肌在早期胚胎中形成和发育的机制尚未彻底阐明，有关绵羊基因的生物信息学分析及在绵羊胎儿不同发育时期半腱肌和背最长肌中表达规律的比较研究鲜有报道，因此，本实验通过qRTPCR 检测了mRNA 在绵羊胎儿不同发育时期半腱肌和背最长肌中的表达变化，并对绵羊Myf5 蛋白序列进行了一系列生物信息学分析，预测了该蛋白的结构特性和下游靶基因，旨在为深入研究绵羊基因的作用机理和表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集本实验采取妊娠30 d（E30）、50 d（E50）和70 d（E70）小尾寒羊胎儿的半腱肌和背最长肌，每种组织各2 份，一份保存于液氮中备用，另一份置于Bouin's 固定液中，4℃保存。

1.2 主要设备和试剂生物组织包埋机、切片机和烤片机均由上海益迪医药设备厂生产；光学显微镜由德国Leica 公司生产；荧光定量PCR 仪由美国BIO-RAD 公司生产；核酸蛋白测定仪由美国Thermo 公司生产；苏木精染液、伊红染液均购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol 试剂和实时荧光定量试剂均购自TaKaRa 公司。

1.3 石蜡切片制备和HE 染色将Bouin's 固定液中的胎羊半腱肌组织和背最长肌组织取出，流水冲洗过夜；修剪组织块并分别用60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精对组织进行梯度脱水；二甲苯透明处理3 次；在生物组织包埋机上用石蜡包埋组织块，然后用切片机进行切片，厚度为6 μm；将切片贴于载玻片上进行脱蜡与水化；分别用苏木精染液和伊红染液对切片进行染色；脱水透明后用中性树胶封片；将切片置于光学显微镜下进行拍照观察。

1.4 引物设计及合成根据GenBank 数据库中绵羊-（NM_001009784.3）和（ΧM_015094556.3）基因mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 设计实时荧光定量PCR 引物（表1），并由北京华大基因生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 实时荧光定量PCR 以-基因为内参，利用TB Green Premix Ex Taq II（2Χ）试剂盒采用两步法进行qRT-PCR 检测。实时荧光定量PCR 体系：TB Green Premix Ex Taq II（2Χ）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，灭菌水补足至10 μL。PCR 扩增程序：预变性95℃ 5 min，PCR反应95℃ 32 s、65℃ 35 s，共40 个循环。每组6 个动物样本，每个样本重复3 次。

1.6 数据统计和分析根据基因和-基因的Ct 值，采用2法计算基因的相对表达量，通过SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，用GraphPad Prism 8.0 软件制作柱状图。＜0.05 表示差异显著，＜0.01 表示差异极显著。

1.7 绵羊Myf5 蛋白生物信息学分析运用表2 中的生物信息学相关软件和网站，对绵羊Myf5 蛋白的结构特征及下游靶基因进行分析。

表2 绵羊Myf5 蛋白结构特征的生物信息学分析软件

2 结果与分析

2.1 胎儿半腱肌和背最长肌组织HE 染色结果 HE 染色结果显示，绵羊胎儿半腱肌和背最长肌组织的显微结构变化相似，随着绵羊胎龄的逐渐增大，肌纤维的数量和横截面积也逐渐增大，同一时期背最长肌的增长幅度相对较大（图1）。

图1 绵羊胎儿不同发育阶段半腱肌和背最长肌的HE 染色结果（50 μm）

2.2 实时荧光定量PCR 结果荧光定量检测绵羊胎儿不同发育阶段半腱肌和背最长肌基因mRNA 的表达变化结果，如图2A 和2B 所示，基因在绵羊胎儿E30～E70 时期半腱肌和背最长肌中mRNA 的表达量均呈持续上升趋势，E50 时期相对表达量分别为E30 时期的1.28 倍和1.43 倍，差异显著或极显著，E70 时期相对表达量分别为E50 时期的1.64 倍和1.43 倍，差异极显著或显著，E70 时期相对表达量分别为E30 时期的2.12 倍和1.73 倍，差异极显著。在同一时期与半腱肌相比，E30、E50 和E70 背最长肌中mRNA 的表达量分别高3.6 倍、3.57 倍和2.73 倍，差异极显著（图2C）。

图2 Myf5 基因mRNA 在绵羊胎儿不同发育阶段半腱肌和背最长肌中的表达

2.3 绵羊Myf5 蛋白生物信息学分析结果

2.3.1 绵羊Myf5 蛋白的理化性质分析结果利用ProtParam 在线网站对绵羊Myf5 蛋白进行分析，结果显示绵羊基因编码255 个氨基酸，其中含量最多的是Ser（S），占比为12.94%，不含Ply（O）和Sec（U）。分子式为CHNOS，分子量为28 282.59。消光系数（280 nm）为23 545，不稳定系数为72.99，等电点（PI）为5.72，表明绵羊Myf5 蛋白是一个不稳定的酸性蛋白。带负电荷的残基数（Asp+Glu）为33，带正电荷的残基数（Arg+Lys）为28。脂肪系数为58.94，平均亲水性系数为-0.658。在大肠杆菌体内预测Myf5 蛋白的半衰期大于10 h，在酵母菌体内的半衰期大于20 h。

2.3.2 绵羊Myf5 氨基酸序列的同源性及系统进化树分析结果运用DNAstar 和MEGA 软件分析绵羊Myf5氨基酸序列的同源性并构建系统进化树。结果表明，绵羊Myf5 氨基酸序列与山羊（NP_001273966.1）、牛（NP_776541.1）、猪（NP_001265704.1）、人（NP_005584.2）、猩猩（ΧP_002823592.1）、食蟹猴（ΧP_005571691.1）、猫（ΧP_003989125.1）、猎豹（ΧP_014919163.2）、田鼠（ΧP_005358152.1）、家犬（ΧP_038544051.1）、大鼠（NP_001100253.1）、小鼠（NP_032682.1）物种之间的同源性分别为100%、99.2%、96.1%、94.5%、94.5%、94.1%、93.3%、92.9%、91.0%、89.0%、89.0%、88.2%；变异度分别为0%、0.8%、4.0%、5.7%、5.7%、6.1%、7.0%、7.4%、9.6%、11.9%、11.9%、12.8%（图3）。系统进化树中绵羊与牛和山羊聚为一支，进化距离最近（图4）。

图3 绵羊Myf5 氨基酸序列同源性分析

图4 绵羊Myf5 氨基酸序列系统进化树

2.3.3 绵羊Myf5 蛋白结构预测及评估运用SOPMA在线网站预测，结果显示绵羊Myf5 蛋白的二级结构中螺旋有81 个，占31.76%；转角有5 个，占1.96%；折叠有23 个，占9.02%；无规则卷曲有146 个，占57.25%（图5A）。利用在线网站SWISS-MODEL 预测，结果显示绵羊Myf5 蛋白的三级结构主要由螺旋和无规卷曲组成（图5B）。利用SAVES 在线网站评估模拟蛋白结构的质量，结果显示，残基在[A,B,L]区域和[a,b,l,p] 区域的比例分别为84.1% 和15.9%，而在[～a,～b,～l,～p] 区域和无标记区域的比例均为0（图5C）。

图5 绵羊Myf5 蛋白结构预测及评估

2.3.4 绵羊Myf5 蛋白的亚细胞定位和结构域预测结果使用在线网站PredictProtein 预测，结果显示绵羊Myf5蛋白主要定位于细胞核（图6A），推测绵羊Myf5 蛋白主要发挥转录因子的功能。通过SMART 在线网站预测，结果显示绵羊Myf5 蛋白在100～200 氨基酸位置处存在一个bHLH 结构域（basic HLH）（图6B）。

图6 绵羊Myf5 蛋白亚细胞定位和结构域预测

2.3.5 绵羊Myf5 蛋白的疏水性分析结果如图7 所示，第207 位氨基酸（亮氨酸）处疏水指数最大为1.433，第94 位氨基酸（精氨酸）处亲水指数最小为-2.622，可以看出氨基酸序列有明显的亲水性区域，表明Myf5蛋白有较强的亲水性，推测绵羊Myf5 蛋白属于亲水性蛋白。

图7 绵羊Myf5 蛋白疏水性分析

2.3.6 绵羊Myf5 蛋白的磷酸化位点分析结果使用Netphos 3.1 在线网站预测绵羊Myf5 蛋白的磷酸化位点，结果显示绵羊Myf5 蛋白含有41 个潜在的磷酸化位点，包括28 个丝氨酸位点，10 个苏氨酸激酶位点，3 个酪氨酸激酶位点（图8）。

图8 绵羊Myf5 蛋白的磷酸化位点分析

2.3.7 绵羊Myf5 的下游靶基因预测结果由表3 可知，绵羊调控的下游靶基因中存在和，结合位点的核心序列是E-box（CANNTG）。

表3 绵羊Myf5 下游靶基因预测结果

3 讨论

骨骼肌是哺乳动物体内数量最多的组织，主要由终末分化的肌细胞组成，具有高度可塑性，对机体的运动和代谢等生理生化功能起着重要作用。Myf5 作为肌源性调节因子，在骨骼肌发育过程中发挥关键作用。该基因对肌细胞增殖和分化有重要影响，当新生小鼠体内缺失基因时，成肌细胞的增殖和分化减少。Myf5 与成肌纤维的数量和大小也有着密切的联系，可以诱导祖细胞向骨骼肌转化。本实验中胎羊半腱肌和背最长肌HE 染色结果表明，肌纤维大多呈短柱状，大多数细胞核呈卵圆形且多位于细胞中央，少部分散布在细胞质边缘，符合肌肉早期发育的特征。随着胎羊胎龄的逐渐增大，肌纤维的数量逐渐增多，横截面积也逐渐增大，而在此发育阶段中基因在半腱肌和背最长肌E30、E50 和E70 时期均存在表达且表达量随发育阶段均呈逐渐上升趋势，说明在绵羊胚胎早期发育阶段，随着胎龄增加骨骼肌组织对Myf5 的需求量不断增多。韩建刚等近期研究表明生肌调节因子MyoD、MyoG、Myf5 和Myf6 在滩羊胎儿E70 发育时期骨骼肌组织中的表达均显著高于E60 时期，说明MRFs 家族各基因表达之间的相关性。本实验进一步的预测结果表明，绵羊Myf5 作为转录因子，其下游靶基因包括和等骨骼肌发育相关基因。因此，可以推测本实验中基因表达随发育阶段E30、E50 和E70 逐渐升高的原因可能是基因作为MRFs 家族中最早被诱导表达的转录因子需要激活其他肌肉发育相关基因的转录表达，从而共同诱导肌肉表型出现以促进绵羊胎儿肌肉组织的最终形成。朱文奇通过研究鸭胸肌和腿肌中Myf5 的表达规律发现，基因的表达具有组织特异性。本实验通过对绵羊半腱肌和背最长肌2 种骨骼肌进行比较研究发现，基因mRNA 在半腱肌和背最长肌的表达随着E30、E50 和E70 胎儿发育时期均呈现相同的升高趋势，但同一时期2 种组织中的表达量并不相同，在背最长肌中的表达量明显要高，这与显微结构中观察到的背最长肌比半腱肌发育较快是相适应的，因为基因的表达是决定成肌细胞增殖分化并形成肌纤维的关键因素。在哺乳动物和鸟类正在发育的体节中，受Hedgehog 和Wnt1 信号蛋白的诱导，基因在体节背内侧区域起始表达，然后进一步启动MRFs 家族其他基因的表达，而基因起始表达的细胞将发育为背肌。可见，与其他物种类似，绵羊Myf5 的组织特异性不仅体现在肌肉特异性表达，而且与肌肉组织的发育部位有着密切关系。

本研究通过生物信息学预测分析表明，绵羊Myf5蛋白定位于细胞核，主要由螺旋和无规卷曲构成，含有典型的bHLH 结构域，与下游靶基因结合位点的核心序列是bHLH 结构域特异性识别的E-box 元件序列（CANNTG），为进一步研究Myf5 蛋白的调控机制奠定了基础。该蛋白包含氨基酸总数为255 个，分子量为28 282.59，等电点（PI）为5.72，不稳定系数为72.99，表明绵羊Myf5 蛋白是一个不稳定的酸性蛋白，可为该蛋白的变性和复性提供一定的理论依据。Myf5 蛋白在大肠杆菌体内和酵母菌体内的半衰期均比较长。有研究表明，半衰期长的蛋白含有信号肽的比例较低，而本实验分析得到的Myf5 蛋白没有信号肽，与其研究结果一致。亲水性平均系数为-0.658，且氨基酸序列有明显的亲水性区域，推测绵羊Myf5 蛋白属于亲水性蛋白，为后期利用基因工程菌对Myf5 体外分泌性表达提供了依据。同源性比对及系统进化树结果显示，绵羊Myf5 氨基酸序列与山羊、牛、猪、人、猩猩、食蟹猴、猫、猎豹、田鼠、相应氨基酸序列的同源性均超过90%，进化树中绵羊与牛和山羊聚为一支，进化距离最近，该结论可为进一步通过比较研究不同物种间Myf5 的功能和结构特点、发现关键作用位点奠定基础。