中国草原红牛MED4 基因第7 外显子多态性与肉质性状的相关性研究

魏铭宏，吴思惠，吕香州，曹 阳，于永生，吴 健,3,4,5，高青山，赵玉民,3,4,5*

（1.延边大学农学院，吉林延边 133002；2.吉林省农业科学院畜牧兽医研究所，吉林公主岭 136100；3.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，吉林公主岭 136100；4.农业农村部东北种牛性能测定中心，吉林公主岭 136100；5.吉林省肉牛繁育及养殖技术科技创新中心，吉林长春 130033）

中国草原红牛是通过英国短角牛与本地牛的级进杂交、横交固定和自群繁育提高等3 个阶段培育而成的第一种肉乳兼用型新品种，具有增重速度快、耐粗饲、肉质鲜嫩、肌间脂肪沉积良好、可以适应北方寒冷的气候条件等优良特性，其屠宰率和净肉率分别可达到56.5%和43.9%，大理石花纹等级平均为5 级，在国内属于优秀肉牛。

是介体复合物的一个亚基，也被称作等。介体是一种多蛋白转录共激活因子，其复合物共包括30 多种亚基（）。作为DNA 结合转录因子诱导RNA 聚合酶II（Pol II）转录所必需的因子，在酵母和哺乳动物等的真核生物中普遍表达。同时介体复合物还可以与许多辅助激活因子和辅助抑制因子相互作用，如可参与Srb10/Srb11（CDK8/CycC）所介导的转录抑制过程。

在介体复合物中，不仅可与PPAR、雌激素受体（ER）、甲状腺激素受体（TR）和维生素D 受体（VDR）等以配体依赖的方式相互作用。相关实验表明，还可影响肌肉纤维的类型，在哺乳动物脂代谢中起重要的调控作用。而表达量的降低可减少与启动子、增强子的结合，进而影响Pol II与启动子的结合，从而降低的调节作用。

目前关于基因的研究多集中于酵母菌等真核生物以及人类癌症、肿瘤等疾病中，关于动物肉质性能等方面的研究鲜有报道，本实验利用Sanger 测序法，以草原红牛为研究对象，检测基因第7 外显子的多态性，分析其与草原红牛肉质性状的相关性，为筛选影响中国草原红牛肉质性状的候选基因提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取遗传背景一致的118 头中国草原红牛（由吉林维多利农牧业有限公司提供），统一饲养至20 月龄，集中屠宰，收集背最长肌进行肉质分析，同时采集肝脏组织，-20℃保存备用。

1.2 DNA 的提取 使用动物组织DNA 提取试剂盒（北京solarbio 生物有限公司）提取118 头草原红牛肝组织基因组DNA，采用超微量分光光度计（Thermo Fisher公司）检测提取的DNA 浓度与纯度，-80℃保存备用。

1.3 PCR 引物设计与合成 参考NCBI 中公布的牛基因CDS 序列（登录号：NM_001034486.1），通过Ensemble 网站查找基因第7 外显子，使用Primer 5.0 设计外显子引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物信息如下：F：5'-GGAAAGAA GAAGAAGTGAA-3'；R：5'-CTACCAAAGTTGGGAT TA-3'。扩增片段939 bp，退火温度51.5℃。

1.4 PCR 反应体系及程序 PCR 反应体系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL（1×）（康为世纪生物科技公司），上下游引物（0.5 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA（＜250 ng/50 μL）1 μL，ddHO 8 μL。

PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、51.5℃ 30 s、72℃延伸1 min，34 个循环；72℃终延伸5 min。产物4℃保存备用。PCR 仪由上海伯乐生命医学产品有限公司生产。

1.5 草原红牛基因SNPs 检测 对PCR 产物进行1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测，将符合预期大小的PCR 产物送金唯智生物公司进行Sanger 测序。使用DNAMAN、Chromas 软件对测序结果进行序列比对，分析碱基变化情况并筛选SNP 位点，统计基因型及基因型频率。

1.6 统计学分析 使用Excel 2010 计算基因（型）频率、Hardy-Weinberg 的卡方适合性检测、遗传纯合度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。公式如下：

其中，公式中n 为等位基因数；p、p表示为第个等位基因频率。

通过SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，分析SNP 位点的不同基因型与肉用性状的关联性，结果以“平均值±标准差”表示，＜0.05 为差异显著标准。

2 实验结果

2.1 草原红牛基因PCR 扩增产物 PCR 产物经凝胶电泳检测发现片段长度与预期扩增片段大小一致（图1），且得到的扩增条带清晰明亮无杂带，可用于测序。

图1 MED4 基因第7 外显子PCR 产物电泳图

2.2 序列分析 利用DNAMAN、Chromas 等软件对测序结果以及测序峰图进行比对，确定基因第7 外显子在A268G 以及A420G 处发生A/G 突变（图2～4），其中A268G 突变导致氨基酸发生改变，由甘氨酸（Gly）变为丝氨酸（Ser），而A420G 突变未导致氨基酸发生改变（图5）。

图2 草原红牛MED4 基因第7 外显子序列对比

图3 A268G 处基因型测序峰图

图4 A420G 处基因型测序峰图

图5 MED4 基因第7 外显子氨基酸比对（7：第7 外显子原始序列）

2.3 草原红牛基因遗传学分析 对草原红牛基因第7 外显子基因（型）频率等指标进行计算（表1～2），结果显示，A268G 处以及A420G 处GG基因型均为优势基因型，G 为优势基因，2 个位点Ho较高，He 较低，0.25＜PIC＜0.5，均处于中度多态；且经卡方检验并对照临界值表得到值范围，二者均处于Hardy-Weinberg 不平衡状态。

表1 草原红牛MED4 基因第7 外显子基因（型）频率

2.4基因第7 外显子不同基因型肉用性状相关性分析结果显示，基因第7 外显子A268G 位点与肉用性状无显著相关，A420G 位点与肉嫩度、pH、L值以及蛋白质含量差异显著（表3），GG 型个体嫩度、pH 显著低于GA 型个体，蛋白含量显著高于AA 型个体，但肉色L 值显著高于GA 型个体。

表2 草原红牛MED4 基因遗传变异参数

表3 MED4 基因第7 外显子A420G 处不同基因型与肉用性状相关性分析

3 讨 论

介体复合物是一种多蛋白复合物，是其中的一种亚基。介体可通过将激活物和抑制物结合的转录因子（TFs）与起始前复合物（PIC）连接，将RNA 聚合酶II（Pol II）招募到特定的基因启动子来调控转录。在结构分类的基础上，介体复合物可分为头、中、尾3个模块，每个模块都由不同的亚基组成，这些不同亚基决定了不同模块在转录中起到的不同作用。目前许多亚基已被发现在生物发育、激素信号、脂肪合成等过程中发挥重要作用。是介体复合物中间模块的组成部分，可与相互作用。在禽类体内，已被发现可调控禽类的生长与胴体性状。也有研究发现可作为影响禽类肌内脂肪（IMF）沉积的候选基因。

本实验通过Sanger 测序法对草原红牛基因进行多态性位点筛选，发现在其第7 外显子存在2 处突变位点，其中A268G 处存在A/G 同义突变，A420G 处存在A/G 错义突变，由甘氨酸（Gly）变为丝氨酸（Ser）。2 处突变均存在GG、GA、AA 3 种基因型，GG 型为优势基因型，G 为优势基因，PIC 属于中度多态，卡方检验样本均处于Hardy-Weinberg 不平衡状态。

基因第7 外显子A268G 处不同基因型的肉用性状无显著差异；A420G 处不同基因型的蛋白质含量、肉嫩度、pH 以及L 值存在显著差异，GG 型个体A420G 处、肉嫩度显著高于GA 型与AA 型个体，pH显著低于GA 型个体，但蛋白含量显著低于AA 型个体。因此在利用遗传标记选择中需要根据不同需求权衡基因型个体。

本研究通过对草原红牛基因SNPs 进行检测及其与草原红牛肉质性状进行相关分析，发现草原红牛基因第7 外显子A420G 处的突变可影响牛肉的嫩度、pH、蛋白质含量等肉质性状，为畜产品品质研究方面提供了参考依据。

4 结 论

本实验对草原红牛基因的第7 外显子进行多态性检测，发现在A268G 处存在A/G 错义突变，在A420G 处存在A/G 同义突变，2 处多态性位点在抽查群体中均处于Hardy -Weinberg 不平衡状态，属于中度多态（0.25＜PIC＜0.5）；第7 外显子在A420G 处不同基因型的蛋白质含量、肉嫩度、pH 以及L 值存在显著差异。