circRNA 及其在畜禽遗传调控中的研究进展

戎友俊，尚方正，马 荣，王 敏，潘剑锋，梁丽丽，张燕军*，李金泉*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业农村部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；4.内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古呼和浩特 010018）

circRNA 是由单个RNA 前体通过反向剪接而成的一种闭合环状的RNA 转录物，发现于包括哺乳动物在内的所有高等真核生物，circRNA 最大的特点是其具有闭合环状结构，从而避免了被RNA 外切酶或者RNA 酶（RNase）降解，从而导致circRNA 在储存时比其他非编码RNA（ncRNA）更稳定。1971 年科研人员研究发现马铃薯纺锤块茎病由类病毒引起。类病毒与其他病毒的不同之处在于其外表面没有蛋白质包裹，仅仅是单链环状的RNA 分子。1979 年，科研人员第一次通过电子显微镜观察到环状的RNA 分子，这种circRNA 分子仅包含外显子结构，稳定存在于细胞质中。但circRNA 在当时并没有引起研究者的重视，而且还被误认为是罕见的转录“噪音”。随着高通量测序技术的迅速发展，circRNA 又重新回到了研究前沿。2012 年，Salzman 等通过对健康和患病的人类细胞测序发现了大量的circRNA，报道了80 多个circRNA。自此，circRNA 的报道屡见不鲜。

大量实验发现，circRNA 在生物体内发挥着重要功能，或直接作用于靶细胞发挥作用，又或通过解除miRNA 对靶细胞的抑制作用来发挥其功能。此外，circRNA 在进行GO、KEGG 功能富集时发挥着相似的功能，相关性较高。在对各个物种进行转录组测序时发现，都存在大量circRNA。本文综述了circRNA 的产生、特征、性质、功能及其在畜禽遗传调控中的应用研究，以期为探究circRNA 在畜禽应用中的功能机制提供理论依据。

1 circRNA 的产生

Jeck 等提出了circRNA 起源的2 个模型，即套索驱动的环化模型和内含子配对驱动的环化模型。如图1 所示，在模型1 中，RNA 前体在转录过程中由于RNA 发生部分折叠，拉近相邻的外显子，使得下游外显子的剪接供体（Splice Donor,SD）的3'端和上游外显子的剪接受体（Splice Acceptor，SA）的5' 端结合，致使外显子跳跃（Exon Skipping），从而产生包含外显子的套索，这种套索是内部拼接的，去除内含子序列形成具有2 个外显子的circRNA。Jeck 等也认为任何外显子跳跃都有可能产生1 个circRNA。在模型2 中，RNA 前体上2 个不相邻的内含子互补配对，使得与这2 个内含子相连的2 个外显子相互接近，下游外显子的剪接供体的3' 端和上游外显子的剪接受体的5' 端结合，反向剪接形成套索，再切除内含子，形成circRNA。2 种模型主要的区别是在circRNA 产生的第一步。第1 种模型要求剪接供体与外显子中的剪接受体共价结合，而第2 种模型涉及2 个内含子内的互补配对，来形成环状结构。circRNA 形成的后续步骤很大程度上是相似的。也就是说，剪接体切除剩余的内含子，形成circRNA。另外，Stagsted 等研究发现富含脯氨酸/ 谷氨酰胺的剪接因子（SFPQ）可以确保长内含子的准确剪接，从而有效保持了内含子的完整性，控制circRNA 的产生。

图1 索尾插接（Backsplicing）形成模型和circRNA 形成机制[3]

此外，有研究表明，选择性环化（Alternative Circu larization）是产生circRNA 的另一种途径，可能的机制如图2 所示。RNA 的这种选择性环化依赖于人类基因组内含子区域包含大量的互补序列（如Alu 序列），这些反向重复的互补序列可以使1 个基因产生多个circRNA 转录物，跨侧翼内含子或单个内含子内的RNA 配对之间的竞争调节了外显子的环化效率。然而，不是所有的互补序列都能促进环化。短内含子重复序列促进了circRNA 产生，而由于RNA 的部分折叠形成的发夹结构稳定性增加抑制了circRNA 产生。

图2 选择性环化的可能机制[14]

2 circRNA 的特征、分类与性质

circRNA 广泛存在于真核细胞的细胞质中，它由mRNA 前体反向剪接产生，具有共价闭合的环，没有5'端帽子和3' 端多聚腺苷酸尾巴，可以调节真核生物中的基因表达。

circRNA 可以由外显子或内含子产生，产生的circRNA分别称为外显子circRNA（Exonic circRNA，ecRNA）、内含子circRNA（circlar intronic RNA，ciRNA）、外显子-内含子circRNA（Exon-intron circRNA，ElciRNA）。ecRNA 位于细胞质中，ciRNA 和ElciRNA 存在于细胞核中，ecRNA 和ElciRNA 成环时，RNA 的3' 端和5' 端磷酸二酯键相连，ciRNA 成环是2' 端和5' 端磷酸二酯键相连；这3 种circRNA 都不受RNA 外切酶（RNase R）的降解作用，而对于脱支酶（Debranching Enzyme）来说，ecRNA 和ElciRNA 不受其作用，ciRNA易受脱支酶的降解。

研究发现，类病毒（Viroids）和丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）的复制方式很类似，最主要的相同点是依赖于宿主DNA 的RNA 聚合酶来启动RNA 基因组的滚环复制，从而产生线性中间体，进一步被切分为较短的单体，最后将这些线性单体的5'端和3'端连接，产生反义circRNA，然后负链circRNA 经过滚环扩增，产生大量正链circRNA 基因组，将感染扩散。因此，circRNA 具有滚环扩增的能力。此外，circRNA 还有重新排列基因组信息顺序的能力、免受核酸外切酶降解的能力、限制RNA 的折叠和结构稳定（图3）。

图3 circRNA 的性质[22]

3 circRNA 的功能

circRNA 可能通过以下几种方式发挥其生物学功能：作为miRNA 海绵；编码、翻译成蛋白质；参与基因转录调控；与蛋白质结合发挥作用。

3.1 作为micorRNAs（miRNAs）的海绵 circRNA 可以作为miRNA 的海绵，与mRNA 竞争miRNA 的靶标结合位点。大部分的circRNA 主要定位于细胞质中，发挥着竞争性内源RNA 机制，所以circRNA-miRNAmRNA 调控网络的研究就成为circRNA 研究的热点。Wang 等建立了小鼠孤独症模型，鉴定出1059 个差异表达的circRNA，构建了circRNA-miRNA-mRNA调控网络，此网络共有9715 个节点，包含1059 个circRNA、6730 个mRNA 和1926 个miRNA 和150408个边。随后对其进行GO 分析，发现这一调控网络主要与“细胞过程”、“生物调节”、“生物过程调节”等有关，KEGG 分析发现，其主要富集在“轴突导向”、“MAPK 信号通路”、“Hippo 信号通路”等，这些研究结果对孤独症发病机制的揭示起着促进作用。

3.2 少量circRNA 也能编码、翻译成蛋白质 circRNA最初被定义为非编码RNA，但随着生物信息学分析技术和高通量测序技术的发展，国内外研究发现，ZNF609基因的二号外显子环化产生的circ-ZNF609，其开放阅读框中包含起始密码子和终止密码子，进一步的蛋白质组学分析以及Western blot 验证发现内源的circ-ZNF609 具有翻译蛋白质的功能，但翻译效率低下，这一功能的发现可能为circRNA 的研究开拓一个新的方向。

3.3 参与基因转录调控 越来越多的实验表明，circRNA 可以调控基因转录。Chao 等在对小鼠（）基因的分析中发现其转录本为环状，这些也是成人大脑和肾脏中在该位点产生的主要转录本。同时，在外显子4 或5 基因靶向缺失的小鼠中未检测到这些环状转录本，即使肢体发育正常，但是这些小鼠还是表现出肾功能发育不全的症状。这说明环状转录本与肾脏发育之间存在联系。作者提出了一个模型，其中，环状Fmn RNA 作为一个功能性的mRNA“陷阱”，在该模型中，所有未加工的Fmn RNAs 被拼接形成一个环状的RNAs 分子，由于没有被翻译成功能性的蛋白质产物，因此成为无功能的RNAs。circRNA的形成使基因产生的转录本陷入无功能状态，并阻止某些可以翻译的正常线性转录物的存在。因此，控制circRNA 形成可以调节正常线性RNA 转录物的表达水平，从而调节基因功能。

3.4 与蛋白质结合发挥作用 circRNA 可以与RNA 结合蛋白（RNA Binding Proteins，RBP）结合发挥作用。Du 等研究发现circ-FoxO3 可以通过结合和p21 蛋白形成三元复合物，抑制的功能，阻断细胞周期进程。不难发现，circ-FoxO3 作为一个蛋白相互作用的脚手架，通过与众多蛋白结合从而影响蛋白的功能，但circ-FoxO3 究竟是以何种方式与蛋白质结合有待进一步研究。

4 circRNA 在畜禽遗传调控中的应用研究

4.1 circRNA 在猪上的应用研究 circRNA 在猪上的研究主要集中于骨骼肌生长发育、脂肪沉积、卵巢的发育方面。

肌肉是生物机体最大的器官，其功能或再生特性丧失会导致肌肉骨骼疾病。研究影响骨骼肌形成的因素有助于解开骨骼肌的分子之谜。circRNA 在猪骨骼肌的形成中发挥着至关重要的作用。Liang 等从贵州小香猪的9 个器官和3 块骨骼肌中鉴定出5 934 个circRNA，发现有149 个circRNA 可能与肌肉生长有关，因为它们的宿主基因显著参与肌肉发育、收缩和染色质修饰等过程。李巧伟等研究鉴定了8 486 条circRNA，并指出3 个与猪骨骼肌生长发育相关的circRNA，即sus-MYH2_0025、sus-CDK13_0002、sus-FANCL_0003，构建了circRNA-miRNA 调控网络。Hong 等对杜洛克猪胚胎肌肉发育中的circRNA 展开研究，发现超过5 000 个circRNA 特异性表达，综合分析了竞争性内源RNA（ceRNA）的图谱，发现circTUT7 在ceRNA 机制中调节HMG20B 的表达，表明circRNA 在猪胚胎的发育中起作用。Li 等构建了猪的股二头肌（Bf）和比目鱼肌（Sol）的circRNA 表达谱，鉴定出Bf 和Sol 肌肉之间242 个差异表达的circRNA，对这些circRNA 进行GO 和KWGG 富集，发现它们主要被富集到骨骼肌纤维相关的信号通路（如AMPK 和cGMPPKG），并构建circRNA-miRNA-mRNA 网络，发现多个circRNA 可充当miR-499-5p 的海绵，miR-499-5p优先在慢肌中表达，并降低杜兴肌营养不良症（DMD）的严重程度，为进一步深入研究circRNA 在骨骼肌纤维形成中的调节机制提供了全面的circRNA 资源。

脂肪组织是猪体内重要的产热器官。Li 等在莱芜猪皮下脂肪组织中，鉴定出275 个差异表达的circRNA，并构建了circRNA_26852-miRNA-mRNA 和circRNA_11897-miRNA-mRNA 调控网络，通过GO 和KWGG 富集分析发现，circRNA_26852 和circRNA_11897的靶基因富集到脂肪细胞分化和脂质代谢相关的途径。左小元在猪脂肪干细胞中鉴定出243 个差异表达的circRNA，这些circRNA 的来源基因富集于PI3K-Akt通路，MAPK 信号通路等，暗示circRNA 可能通过这些信号通路影响细胞多能性。

卵巢细胞的发育程度是衡量猪繁殖力的重要指标。Guo 等在猪健康卵巢和闭锁起始阶段的窦卵泡中筛选出197 个差异表达的circRNA，通过预测circRNA 与miRNA 的靶向关系，确定出16 个功能性的miRNA。Cao 等在卵丘细胞和卵母细胞中鉴定出7 067 和637个circRNA，circRNA 的宿主基因显著富集于卵丘细胞功能和卵母细胞成熟相关的多种信号通路中，这些结果表明circRNA 对猪卵母细胞的成熟至关重要。

4.2 circRNA 在反刍动物中的应用研究 circRNA 在羊上的研究较为广泛，在羊的组织、各类细胞、子宫上都鉴定出circRNA。Varela-Martínez Endika 等进行了绵羊外周血单核细胞和顶叶皮层中circRNA 的研究，在顶叶皮层和外周血单核细胞中分别检测到了2510 个和3403 个circRNA，共发现了1379 个新的circRNA。GO 和KEGG 功能富集分析表明来自脑的circRNA 在突触功能中发挥着重要作用，来自外周血单核细胞的circRNA 参与基本免疫系统功能。Yin 等在绒山羊次级毛囊干细胞中鉴定出了circRNA-1926。经过研究发现，circRNA-1926 作为miR-148a/b-3p 的海绵来促进CDK19 基因的表达，并且促进绒山羊次级毛囊干细胞向毛囊谱系的分化。Zhang 等发现在奶山羊乳腺上皮细胞中，circRNA-006258 可以作为miR-574-5p的海绵，并通过同向性病毒5 样结合位点（Ecotropic Viral Integration Site 5-like,EVI5L）来调节细胞生长和乳汁合成，这可能为奶山羊的育种提供科学依据。Song 等分析了妊娠期山羊子宫内膜中circRNA 的表达谱，鉴定出21813 个circRNA。其中，在子宫内膜的接收态前期（Pre-receptive Endometrium,PE），有9078 个circRNA 是特异性的；在子宫内膜的接收态期（Receptive Endometrium,RE），有5925 个circRNA是特异性的。通过进一步的研究发现，和PE 相比较，RE 有334 个差异表达的circRNA。Zhang 等发现circRNA-9119 可以作为miR-26a 的海绵，预测了奶山羊子宫内膜上皮细胞的靶位点，而miR-26a 通过此位点来下调前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandinendoperoxide Synthase 2,PTGS2）的表达。作者指出，子宫内膜上皮细胞中的circRNA-9119-miR-26a-PTGS2通路可能成为调控RE 发育的潜在靶点。La 等比较了苏尼特绵羊子宫组织在3 种不同光周期，即短光周期（SP）、短转长光周期（SLP）和长光周期（LP）中的基因表达谱，结果发现，有124、270、400 个差异表达的circRNA 分别存在于SP 和LP，SP 和SLP，LP 和SLP 中，差异表达的RNA 主要参与GnRH 信号通路、甲状腺激素合成和甲状腺激素信号通路。这些发现可能有助于揭示绵羊季节性繁殖的分子机制。

circRNA 主要与牛的成肌细胞和脂肪细胞相联系，以探究牛肉品质的影响因素。Liu 等对山东黑牛和鲁西牛的背最长肌进行转录组测序后，鉴定了14640个circRNA，其中有655 个circRNA 差异表达，并发现它们参与多种生物过程，如肌纤维发育、平滑肌细胞增殖、骨系统形态发生等等。也鉴定出circ0014518 和miR-1 有结合位点，为后续的实验奠定了基础。Huang等探究了影响黄牛和水牛肌肉品质的分子机制，利用RNA-seq 技术检测到10 449 个circRNA，有1128个circRNA 差异表达，验证发现circEch1 是肌肉发育过程中差异最显著的circRNA 之一，过表达circEch1可以抑制牛成肌细胞增殖，促进分化，circEch1 还能够促进骨骼肌再生，表明circEch1 诱导成肌细胞分化和骨骼肌再生，这也为circRNA 调控牛肉品质的机制提供了新的见解。蒋瑞筛选出了与脂肪发育相关的circFUT10，验证发现其与let-7c 结合来促进脂肪细胞增殖，从而为秦川牛的育种工作提供理论依据。Li 等发现miR-107 抑制牛成肌细胞的分化和凋亡，但不影响细胞的增值，circFGFR4 不影响细胞增值，但结合miR-107 之后可促进成肌细胞的分化和凋亡，并减轻其对Wnt3a 的抑制作用，从而验证了CircFGFR4-miR-107-Wnt3a 调控网络，为牛的肌肉研究提供分子基础。

4.3 circRNA 在禽类中的应用研究 禽病是影响养殖户经济效益的重要因素，探究其免疫机理的影响因素对于预防和治疗禽病有着非同寻常的意义。Yu 等探究了柔嫩艾美耳球虫感染鸡盲肠后circRNA 表达谱的变化，构建了circRNAs-mRNA 共表达网络，发现circRNA2202 和circRNA0759 与（）的表达呈正相关。因此，这两个circRNA 可能通过调节基因参与球虫感染的免疫应答。Yang 等发现circRNA-3079 广泛表达于鸡的各种组织中，circRNA-3079 和预测的靶基因在许多与免疫或肿瘤相关的通路中富集，如p53 信号通路，Jak-STAT 信号通路等，揭示了circRNA-3079 可能通过调节靶基因间接调节禽白血病病毒（ALV-J）的感染过程。Shen 等分析了鸡卵泡发育过程中卵泡膜细胞中的circRNA，鉴定 出14 502 个circRNA，其中5 622 个circRNA 广泛分布于所有发育阶段。这些信息表明circRNA 在卵泡膜细胞发育过程中的代谢和免疫过程以及凋亡、增殖和分化中起着重要作用。

骨骼肌是生物体最重要的组成部分，也与家禽的生产力息息相关。Ouyang 等对不同胎龄鸡的腿部肌肉进行测序，鉴定出13377 个circRNA，其中有462个circRNA 差异表达，说明circRNA 在鸡的胚胎期肌肉发育过程中大量存在并动态表达，并且可能与骨骼肌的生长有关。随后又探讨了circSVIL 对骨骼肌发育的影响，发现circSVIL 在鸡胚胎骨骼肌发育后期高水平表达。circSVIL 作为miR-203 的海绵，并上调靶基因和的表达，从而促进鸡胚胎骨骼肌的发育。Shen 等发 现circTMTC1 作 为miR-128-3p 的海绵在机体内发挥作用，circTMTC1 的敲除加速了鸡骨骼肌卫星细胞（SMSCs）的增殖和分化；而且，过表达circTMTC1 则抑制了SMSCs 的生长，所以在生产实践中，可以抑制circTMTC1 来达到让骨骼肌生长的目的。

5 展 望

自1990 年人类基因组计划启动以来，研究者的目光大多集中在人类的DNA 和编码RNA 上，而对于非编码RNA 的研究极少。高通量测序技术的迅速发展使得miRNA、lncRNA 和circRNA 逐渐受到研究人员的重视，但大多数的研究集中在人类癌症等疾病方面，在动物上这些非编码RNA 是如何表达以及发挥调控作用的研究也相对匮乏，只在部分动物的个别性状有所研究，自然也就缺乏相关的数据库。因此，运用转录组测序、芯片等技术在动植物上建立更多非编码RNA 的数据库从而为探究其具体的功能机制奠定基础是后续探究非编码RNA 的一项重要工作。

同时，circRNA 的研究还处在遗传调控方面，而对于细胞生物学机制还没有特别成熟和系统的研究，只能通过转录组数据或者免疫组化等技术来研究一个物种的某个组织或者细胞发生发育有哪些circRNA 在发挥调控作用，而这些circRNA 如何来调控细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等具体机制还有待进一步研究。在更多物种中开展circRNA 的研究和进一步探究circRNA 的机制对发现未知领域和揭示机体生命活动具有重大意义。因此对于circRNA 的研究仍有很长的路要走。