基于豌豆细菌性疫病菌适配体的表面增强拉曼技术鉴定豌豆细菌性疫病菌的研究

李建勇，王英超，李晓明，陈晞,张欢欢，张卫华

（1.济南海关技术中心，山东 济南 250014；2.青岛海关技术中心，山东 青岛 266002；3.山东省农业科学院，山东 济南 250014）

在口岸检疫中，存在植物病原细菌分子检测采用分子进化标记单一；种传病害中致病菌的含量低而难以施检；有些病原细菌的致病变种不能很好的区分；很多致病性细菌基因水平研究不够深入，并且病原细菌在不同状态下很容易发生变异，致使很多疾病在其发病早期无法检测到或是被漏检等问题，因此在植物检疫领域，建立基于SELEX技术的植物病原细菌特异性寡核苷酸适配体的筛选，通过筛选到的寡核苷酸适配体，结合磁珠富集技术、表面增强拉曼光谱(Surface enhanced raman spectroscopy,SERS)技术进行致病菌快速、高通量检测，并形成体系[1]。表面增强拉曼光谱（SERS）的检测结果具有很好的特异性和准确性，被广泛用于不同生物分析以及完整细菌细胞的种属和品系的鉴定。通过拉曼光谱仪检测出分子的特征电磁波，省去微生物鉴定中的预增菌、提取和纯化等步骤，从而节省时间。表面增强拉曼光谱增强基底有金纳米颗粒、银纳米颗粒、其他重金属纳米颗粒，以及多样的核/壳结构纳米颗粒、硅片和复合材料等。本研究主要是利用已经获得的丁香假单胞菌豌豆致病变种特异性核酸适配体Ppi1，分别生物素化和巯基化后得到生物素化和巯基化的Ppi1。以适配体修饰的磁性纳米颗粒（四氧化三铁）作为捕获探针，巯基苯甲酸与丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.Pisi)适配体同时修饰的金纳米颗粒作为信号探针，利用表面增强拉曼技术实现丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.Pisi)检疫鉴定；不仅为植物病原细菌致病变种和植原体病害的快速检测方法建立奠定基础，而且实现了植物病原菌快速检测的整套解决方案。

1 材料和方法

1.1 实验仪器

Progeny便携式增强拉曼光谱仪（Rigaku）；恒温震荡培养箱；高压灭菌器（三洋）；低温冰箱；培养皿；日立高速冷冻离心机（CF16RXⅡ）；超声波清洗仪；PCR管；微量可调加样器（2微升，10微升，20 微升，100 微升，200 微升，1000 微升）；加样器枪头（2-20微升，20-200微升，200-1000微升）。

1.2 供试实验材料和主要试剂

豌豆细菌性疫病菌捕获探针采用巯基化的Ppi1适配体：

5‘SH-AGGTCAGATGTCACGCCCGCTCACT CCCGCCTGTTGTCCCCTCGCTCCCCCCTATGCGT-3’，大连宝生物合成。金纳米颗粒，燕山大学刘志伟老师惠赠；90%4-巯基苯甲酸；PBS缓冲液；

1.3 捕获探针的制备

生物素化豌豆细菌性疫病菌适配体与亲和素化磁性纳米颗粒的结合，获得捕获探针。首先，取1 mL亲和素化磁性纳米颗粒于2 mL离心管中，加入10 μL，10μmol/L生物素化豌豆细菌性疫病菌适配体，在27℃摇床中反应12 h，得到的产物用10 mmol/L磷酸盐缓冲液清洗三遍，储存在4℃冰箱备用。

1.4 信号探针的设计和制备

巯基化豌豆细菌性疫病菌适配体、4-巯基苯甲酸修饰的金纳米颗粒的制备。在1毫升的金纳米颗粒溶液中加入0.1 mL，1 mmol/L 4-巯基苯甲酸。在摇床中反应24 h（27℃，260 rpm）。离心去除未反应的4-巯基苯甲酸，将沉淀分散在1 mL，10 mmol/LPBS缓冲液中，然后向该溶液中加入2 μL巯基化豌豆细菌性疫病菌适配体溶液在摇床中反应24 h（27℃，260 rpm）。最后12,000 rpm离心25 min，去除未反应的适配体，得到4-巯基苯甲酸修饰的金纳米颗粒，放在4℃冰箱备用。

1.5 鉴定方法步骤

将培养的豌豆细菌性疫病菌(OD=0.4)菌液进行梯度稀释，取4个梯度进行检测，分别编号为LM1、LM2、LM3、LM4，同时对每个梯度进行平板计数。将1.3得到的捕获探针重分散于10 mmol/L磷酸盐缓冲液中，取100μL加入到2 mL离心管中，然后加入50 μL三个不同浓度的豌豆细菌性疫病菌菌液，充分混匀，置于摇床（27℃，260 rpm）中反应60 min。生产的混合物通过外加磁场分离出来，用10 mmol/L磷酸盐缓冲液清洗三遍，重分散于50 μL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液中，再向该反应体系加入100μL信号探针，混合均匀，置于摇床（27℃，260 rpm）中反应 60 min。 最后在磁场作用下分离，用10 mmol/L磷酸盐缓冲液清洗三遍，重分散于50 μL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液中，进行表面增强拉曼光谱测试。拉曼仪器参数中，影响拉曼信号主要为扫描功率和扫描时间，综合考虑，拉曼仪器参数设置为：仪器功率1000nm，扫描功率280 mW；扫描时间10 s。以不加豌豆细菌性疫病菌为空白对照、加西瓜细菌性果斑病菌、十字花科黑斑病菌的为阴性对照，看其特异性。

2 结果与分析

由图1-4可知，以适配体修饰的磁性纳米颗粒（四氧化三铁）作为捕获探针，巯基苯甲酸与丁香假单胞菌豌豆致病变种 (Pseudomonas syringae pv.Pisi)适配体同时修饰的金纳米颗粒作为信号探针，能够利用表面增强拉曼技术实现丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.Pisi)检疫鉴定，在580cm-1和930 cm-1出现特征峰，而空白对照（参见图7）和阴性对照（参见图5和图6）均未出现上述特征峰。在其他条件不变的情况下，随着浓度的递减，拉曼信号也逐渐减弱，根据平板计数结果，LM1、LM2、LM3、LM4 的浓度分别为 105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml。

图1 豌豆细菌性疫病菌LM1 SERS光谱图

图2 豌豆细菌性疫病菌LM2 SERS光谱图

图3 豌豆细菌性疫病菌LM3 SERS光谱图

图4 豌豆细菌性疫病菌LM4 SERS光谱图

图5 西瓜细菌性果斑病菌SERS光谱图

图6 十字花科黑斑病菌SERS光谱图

图7 对照SERS光谱图

3 结论与讨论

目前，国内外有关豌豆细菌性疫病菌分子检测方面的报道，主要集中在普通PCR、实时荧光技术、环介导等温扩增技术（LAMP）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、红外光谱检测技术等技术[2-7]。而基于SELEX技术筛选豌豆细菌性疫病菌特异性的核酸适配体，并且将核酸适配体结合表面增强拉曼光谱技术进行豌豆细菌性疫病菌菌的鉴定还鲜有报道。因此，本研究具有一定的创新性。

本研究基于豌豆细菌性疫病菌适配体修饰的磁性纳米颗粒（四氧化三铁）作为捕获探针，巯基苯甲酸与豌豆细菌性疫病菌适配体同时修饰的金纳米颗粒作为信号探针，能够利用表面增强拉曼技术实现豌豆细菌性疫病菌的检疫鉴定；并且具有一定的特异性。该方法具有特异性强，灵敏度高，检测步骤简单、快速，周期短，仅耗时几十秒左右。能够较好的满足口岸检疫及“大通关”工程的需要，为保护我国的农产品出口安全提供了强有力的技术保障。

由于时间和经费所限，本研究后续工作还需要对实验条件进行优化，选择更多的对照菌验证方法的特异性，比较该方法与常规检测方法的灵敏度存在的差别；在复杂环境下，在不分离纯化细菌条件下鉴定出目标菌等；进一步提高该方法的适用性，灵敏度，重现性和准确性。