基于网络药理学分析中医药防治宫腔粘连的作用机制

张丽美 刘云平 邱 丽 刘 瑾 钟晓玲▲

1.深圳市中医院妇科，广东深圳 518033；2.深圳市中医院超声科，广东深圳 518033；3.深圳市中医院生殖健康科，广东深圳 518033

宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）临床表现为经量过少、闭经腹痛、不孕或反复胚胎丢失等[1]。 宫腔手术的女性继发IUA 的占比为25%～30%[2]。 西医治疗IUA 通常采用宫腔镜下IUA 分离术及口服雌孕激素等方法，但中重度IUA 仍有一定的复发率[3]。 近年来， 许多文献均报道，IUA 术后中西医结合治疗可明显降低其IUA 复发率，且已有学者对该类文献中核心处方进行数据挖掘[4-5]，但对中医药防治IUA 的具体机制及作用靶点仍不明确。 本研究选取治疗IUA 的高频中药作为研究对象，通过网络药理学方法对其防治IUA 的作用机制进行进一步解析， 期望能为临证配伍和进一步实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 高频中药的统计

本研究以“宫腔粘连”“数据挖掘”或“组方规律”或“用药规律”或“处方分析”作为检索词，收集建库至2021年6月公开发表在中国知网、维普网、中国生物医学文献数据库有关中医药治疗IUA 的数据挖掘类文献。 全文均有明确的药物累计频次信息，统计文献中高频次中药。

1.2 高频中药化学成分及靶点预测

从文献研究中获得治疗IUA 的高频中药，设置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，运用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinse Medicine Systerms Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）筛选高频中药的全部化学成分及靶点蛋白，将去重后的药物靶点蛋白导入通用蛋白数据库Uniprot（https://www.uniprot.org）中，获得高频中药对应的人源基因靶点名称。

1.3 IUA 疾病靶点筛选及靶点网络

以“intrauterine adhesion”作为检索词，通过人类基因数据库GeneCards（https://www.genecards.org/）获得IUA 疾病靶点，作为IUA 疾病基因数据库。将药物、药物有效成分及疾病基因导入Cytoscape 3.7.2 软件中将其关系可视化。

1.4 药物-疾病靶点蛋白互作网络

通过Venny2.1 软件获得药物与疾病的交集靶点，将其输入STRING 数据库（https://string-db.org/），来源设置为“Homo sapiens”，选择minimum required interaction score 为high confidence 0.9，并勾选hide disconnected nodes in the network，获取高频中药治疗IUA 潜在作用靶点的蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI），将结果导入Cytoscape 中进行可视化显示。同时在该软件的CytoNVA 插件中筛选核心靶标， 网络拓扑分析筛选条件为：degree centrality（DC）、betweenness centrality（BC）、closeness centrality（CC）均大于中位数。

1.5 核心靶标基因本体富集分析及基因组百科全书通路分析

通过网络拓扑分析获得的核心靶标导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），种属和背景选择 “Homo sapiens”， 分别进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析，两者均设定P＜0.01，错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.01 作为筛选条件。 其中GO 富集内容包括：生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）三个内容，GO 富集分析结果采用R4.1.0 软件输出直方图，KEGG 分析以气泡图形式体现。

1.6 分子对接验证

利用PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载Degree 值排列前3 位的核心靶点的3D 蛋白结构文件，设置以下选择条件：①Homo sapiens 来源；②分辨率≤2.5 A；③小分子配体信息详细，蛋白结构完整；④pH 值在人体正常生理范围；⑤通过X-ray 方法解析。 将筛选后的蛋白结构通过PyMol 2.3.0 软件进行预处理。 通过TCMSP 数据库下载Degree 值排名前3位的化学成分结构文件。 将处理后核心蛋白结构和小分子结构导入Autodock 1.5.6 软件进行分子对接。

2 结果

2.1 高频中药筛选结果

检索得到2 篇中医药治疗IUA 的数据挖掘类文献[4-5]，分别统计两篇文献中排名靠前的高频次中药，结果见表1。 结果显示，两者的共同高频中药是当归、熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝，后文将以此作为研究对象。

表1 治疗IUA 中药复方中的药物频次统计

2.2 高频中药化学成分筛选

将高频中药当归、熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝分别作为检索词，运用TCMSP 数据库获得全部化学成分， 去重并去除无对应靶点成分后共纳入50 个药物活性化学成分，结果见表2。

表2 高频中药化学成分信息表

2.3 IUA 相关基因靶点及与药物交集靶点

通过GeneCards 数据库获取IUA 疾病靶点共3743 个。将“2.2”项下纳入的50 个药物化学活性成分导入Uniprot 数据库中，去重后获得202 个人源基因靶点名称。 运用Venny 软件选取交集，得到147 个高频中药治疗IUA 的潜在作用靶点，结果见图1。

图1 药物-疾病潜在作用靶点

2.4 药物-有效成分-疾病靶点网络

将数据导入Cytoscape 软件中将其关系可视化。结果显示， 按照Dgree 值排列前3 位的是豆甾醇、山奈酚、槲皮素，三者分别是高频中药治疗IUA 的主要活性成分（图2）。

图2 药物-有效成分-疾病靶点网络图

2.5 药物-疾病靶点PPI 网络图

将交集基因输入STRING 数据库， 得到药物-疾病的PPI 网络，结果见图3，包括138 个节点、492 条相互作用线，平均节点度为7.13，平均局部聚类系数为0.423。

图3 高频中药治疗IUA 的PPI 网络图

采用CytoNCA 插件筛选核心靶标， 其中各项中位数为：DC=5、BC=61.968、CC=0.174，共获得64 个核心靶点。 按DC 排名前3 位的基因靶点是：TP53、STAT3、MAPK1， 提示这些靶点在高频中药治疗IUA中尤为重要。 排名前5 位核心靶点结果见表3。

表3 按DC 排名前5 位的网络拓扑分析结果

2.6 GO 富集分析

将核心靶点导入DAVID 数据库，结果显示：BP92条，MF 22 条，CC 12 条，主要涉及凋亡过程、细胞增殖调控、药物反应等生物过程，胞质、核浆、细胞外区域等细胞结构以及蛋白结合、酶结合、转录因子结合等分子功能， 筛选排名前10 位的GO 富集进行可视化处理，结果见图4。

图4 排名前10 位GO 富集分析直方图

2.7 KEGG 信号通路分析

核心靶点导入数据库共获得117 条富集通路，筛选后有83 条信号通路符合条件。 分析提示核心靶点与T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体信号通路等有关， 运用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn）对筛选后的前30 条KEGG 通路结果进行可视化处理，见图5。

图5 核心靶点的KEGG 信号通路分析（前30 位）

2.8 分子对接结果

利用Autodock 软件将主要成分豆甾醇、山奈酚、槲皮素与排名前3 位的核心靶点TP53、STAT3、MAPK1 进行分子对接，结果见表4，结果显示，相互间的结合能均<-5.0 kcal/mol，提示核心靶点与化学成分间的对接均有较好的结合能力。并将结合活性强烈的豆甾醇与MAPK1 组输入PyMol 软件进行可视化，结果见图6。

图6 豆甾醇与MAPK1 分子对接结果

表4 不同核心靶点与化学成分分子对接的结合能（kcal/mol）

3 讨论

肾虚血瘀为IUA 最主要病机[6]，数据挖掘类文献统计出中医学者治疗IUA 时选取当归、 熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝等药物的用药频次高，与肾虚血瘀病机相呼应。 其中，位居首位的当归为补血要药，同时具有行血之效，熟地黄为“至阴之药”，善于滋补肝肾阴血；两者互用补而不滞。 川芎、桃仁、红花、牛膝为血府逐瘀汤的重要组成部分， 该方为治疗血瘀证的经典名方，除心脑血管疾病外，妇科疾病的应用亦颇多[7]，且活血类中药具有促进血管新生、改善血液流变学、促进内膜局部血液循环、阻止粘连再次发生的效果[8-9]。 现代中医学者选取此类中药防治IUA，临床疗效十分满意[10]。

中药配伍后防治IUA 的具体作用机制不明，本研究利用网络药理学发现高频中药治疗IUA 的有效成分主要是豆甾醇、山柰酚、槲皮素等，三者主要涉及炎症-免疫反应、细胞周期调控。豆甾醇可明显抑制白介素（interleukin，IL）-1、IL-6 等以达到抗炎作用，且可下调相关信号通路起到抑制肿瘤的作用[11]。 山柰酚可抑制蛋白激酶活性，影响细胞增殖周期[12]。 槲皮素是最有效的抗氧化剂，可穿过细胞膜发挥抗炎及抑制细胞周期的作用[13]。 主要化学成分与TP53、STAT3、MAPK1 等靶点基因的关系尤为密切， 且通过分子对接验证主要化学成分与前三者均有较好的结合能力。 其中TP53 可促进DNA 修复、使细胞周期停顿或凋亡[14]，STAT3 可促进促血管生成的关键调节信号的生成，介导细胞的生长、凋亡等过程[15]。激活MAPK 家族可促进子宫内膜上皮细胞增殖，改善子宫内膜容受性[16-17]。 核心靶点基因亦涉及炎症反应、细胞周期调控，与高频中药的主要化学成分药效不谋而合。 而目前IUA 的治疗方法中， 除了物理隔离外， 包括干细胞、透明质酸钠的宫腔注射及血管扩张剂、雌激素的口服应用等均可促进内膜细胞增殖分化、 抑制内膜局部炎症的作用[18]。 通过GO 富集分析可预测，这些核心靶标主要在胞质、核浆、细胞外区域等位置发挥作用，并通过药物反应、凋亡过程、细胞增殖调控等生物过程发挥蛋白结合、酶结合、转录因子结合等分子功能。

KEGG 富集分析发现，高频中药治疗IUA 可能通过上述核心靶标诱导下游转录因子，激活T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体信号通路等发挥作用。 其中T 细胞受体信号通路、Toll 样受体信号通路均为炎症-免疫反应通路，Toll 样受体信号通路不仅参与炎症反应，对内源性损伤模式分子亦有识别作用，参与非特异性免疫[19]。 PI3K-Akt 信号通路生理状态下表达低下，当细胞损伤后，会迅速激活促进细胞增殖[20]。

综上所述， 现代中医学者防治IUA 选取的高频中药可能通过调控内膜细胞周期、 局部炎症-免疫调节等生物环节起到预防IUA 复发的作用。 本研究为中医药治疗IUA 临证选药及实验提供数据支持，但本研究同时存在一定不足， 如未对文献质量进行评价、文献中临床药方有限，研究样本量少，尚处于理论层面， 对高频中药治疗IUA 的作用机制仍需开展实验研究加以证实。