针刺联合重复经颅磁刺激疗法治疗帕金森病的疗效及对miR-103a、miR-214表达的影响

侯鑫磊，唐 强，朱路文，李宏玉，宋 琦，王丹丹

帕金森病为一种神经系统变性疾病，其首发症状为静止性震颤，主要表现为姿势异常、运动迟缓、僵直等，多数病人伴随着抑郁、认知功能损害、睡眠障碍、运动受限以及便秘等[1]。研究显示，随着年龄的增加，帕金森病的发生率随之升高。目前，我国老龄化较为严重，导致帕金森病的发生率呈现逐年上升的趋势[2-3]。目前帕金森病的治疗多以药物治疗为主，多数病人需要长期使用左旋多巴等药物，但长期使用会给病人带来不同程度的毒副作用，不利于疾病的恢复[4-5]。因此，寻找合理有效的治疗帕金森病的手段，对促进疾病的恢复具有重要的意义。本研究探讨针灸联合重复经颅磁刺激疗法治疗帕金森的效果，以期为临床治疗提供新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月—2020年8月黑龙江中医药大学附属第二医院收治的帕金森病病人156例为研究对象，按照随机数字表法分为磁刺激组、联合组，每组78例。磁刺激组，男42例，女36例；年龄52～70(61.78±3.76)岁；病程(4.78±1.29)年。联合组，男43例，女35例，年龄56～80(62.39±2.35)岁；病程(4.70±1.22)年。两组病人性别、年龄、病程、基础疾病等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，所有病人及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合《帕金森病抑郁中西医结合诊断与治疗专家共识》中帕金森病的相关诊断标准[6]；未使用临床手段治疗、无治疗禁忌证、意识清楚者。排除标准：有特发性震颤或其他影响神经系统的疾病；沟通障碍者；严重痴呆者；合并癫痫等精神疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并严重的心脑血管疾病者；有颅脑损伤、脑血管意外等疾病史；合并心、肝、肾等多脏器功能不全者。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 参照2014年《中国帕金森病治疗指南(第三版)》[7]，两组病人均行常规治疗。磁刺激组采用重复经颅磁刺激疗法治疗，采用丹麦Dantec公司生产的磁刺激器Magpro100及8字形线圈行重复经颅磁刺激治疗，最大磁场强度4.2 T，单圈外径为70 mm，刺激部位在左前额叶背外侧，开始强度在90%～100%，刺激频率为0.5 Hz，每串刺激300 s，间歇30 s，刺激750次，每周2次，连续治疗8周。联合组采用针灸联合重复经颅磁刺激疗法，重复经颅磁刺激疗法同磁刺激组。针灸：取“颅底七穴”，即哑门、双侧风池、双侧完骨、双侧天柱，使用2寸不锈钢毫针。从哑门垂直进针，向下颌或者鼻尖方向缓慢刺入，刺入1.5寸，并在1.0～1.5寸范围内提插9次，在此过程中注意进针深度，避免刺入硬膜；风池穴垂直进针，向对侧鼻尖刺入1.2寸；完骨穴垂直进针，向鼻尖方向刺入1寸；天柱穴垂直进针，向鼻尖或下颌方向刺入1寸。均以捻转手法，频率为120次/min，平补平泻，持续2 min，留针30 min。每日1次，连续治疗8周。

1.3.2 P300潜伏期、波幅检测 治疗前、治疗后1 d，两组病人均行实施事件相关电位(ERP)P300检查，使用美国美敦力公司所提供的4通道全功能肌电图诱发电位仪检测靶刺激下P300潜伏期、波幅。

1.3.3 脑神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺(NE)、多巴胺(DA)、同型半胱氨酸(Hcy)、胱抑素C(CysC)水平检测 采用酶联免疫吸附试验法(ELISA法)检测5-HT、NE、DA、Hcy、CysC水平，采集病人治疗前、治疗后清晨空腹静脉血3 mL，分离血清，将所制备的上清液置于室温后，取出试剂盒，标记酶标板，制作标准品，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入四甲基联苯胺稀释好的待测血清及标准品每孔100 μL，放置37 ℃恒温孵育箱中湿育2 h；用专用洗涤液将反应板清洗3次后，加入抗体工作液(1∶100倍稀释后)每孔100 μL，置于37 ℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入四甲基联苯胺(TMB)溶液每孔100 μL，置于37 ℃恒温孵育箱中湿育45 min后在反应孔内加入终止液每孔100 μL以终止反应，检测5-HT、NE、DA、Hcy、CysC水平。

1.3.4 微小RNA-103a(miR-103a)、微小RNA-214(miR-214)表达量检测 采集病人治疗前、治疗后1 d清晨空腹外周静脉血3 mL，分离出单个核细胞，采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测血miR-103a、miR-214表达量，利用Trizol法提取单个核细胞总RNA，使用紫外分光光度仪对所提取的RNA纯度进行检测，总RNA纯度鉴定运用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。利用miR CURY LNA Universal RT microRNA聚合酶链式反应(PCR)试剂盒合成cDNA。逆转录：14 μL模板RNA、2 μL Enzyme mix，4 μL 5×RT缓冲液，补至20 μL，在PCR检测仪上42 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min，之后将所合成的cDNA放置于温度为-20 ℃环境下进行保存。反应体系：8 μL cDNA模板、10 μL SYBRP Green mix、2 μL PCR Primer mix。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 1 min；40个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct方法计算所有研究对象miR-103a、miR-214表达量。

1.3.5 认知功能评分、生活质量评分、中医证候积分评价 采用简易智力状态评分(MMSE)量表评价病人认知功能，包括地点定向力、时间定力等，该检测表总分50分，分数越低说明病人认知能力障碍越严重。采用统一帕金森病评定量表(UPDRS)进行生活质量评分，该评分包括UPDRS-Ⅰ(精神行为情绪)、UPDRS-Ⅱ(部分日常生活活动)、UPDRS-Ⅲ(部分运动)3个分量表，分值越高说明病人疾病表现越严重。参照《中医老年颤证诊断和疗效评定标准》对病人中医证候进行评价，包括肢体或者头部颤振、智力减退、颈部僵直、肢体拘紧、活动笨拙、少动、失忆、耳鸣、头晕头痛等，根据轻重程度计0～3分，分数越高说明病人症状越严重[8]。

1.3.6 临床疗效评价 根据UPDRS对病人临床疗效进行评价，分为显效、有效、无效3个等级，显效：病人治疗后临床症状完全消失，UPDRS减分率≥46%；有效：病人治疗后临床症状明显改善，UPDRS减分率在15%～45%；无效：病人治疗后临床症状未改善，且有加重的趋势，UPDRS减分率<15%。治疗总有效率=显效率+有效率，UPDRS减分率=(治疗前评分-治疗后评分)/治疗前评分×100%[9]。

2 结 果

2.1 两组P300潜伏期、波幅比较 治疗前，两组P300潜伏期、波幅比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组P300潜伏期降低，波幅升高，且联合组P300潜伏期低于磁刺激组，波幅高于磁刺激组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组P300潜伏期、波幅比较(±s)

2.2 两组血清脑神经递质5-HT、NE、DA水平比较 治疗前，两组5-HT、NE、DA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组5-HT、NE、DA水平均较治疗前升高，且联合组5-HT、NE、DA水平高于磁刺激组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血清脑神经递质5-HT、NE、DA水平比较(±s)

2.3 两组Hcy、CysC水平比较 治疗前，两组Hcy、CysC水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组Hcy、CysC水平均较治疗前降低，且联合组Hcy、CysC水平低于磁刺激组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组病人Hcy、CysC水平比较(±s)

2.4 两组miR-103a、miR-214表达量比较 治疗前，两组miR-103a、miR-214表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组miR-103a、miR-214表达量均较治疗前降低，且联合组miR-103a、miR-214表达量低于磁刺激组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 两组miR-103a、miR-214表达量比较(±s)

2.5 两组MMSE评分、UPDRS评分、中医证候积分比较 治疗前，两组MMSE评分、UPDRSⅠ-Ⅲ评分、中医证候积分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组MMSE评分较治疗前升高，UPDRSⅠ-Ⅲ评分、中医证候积分较治疗前降低，且联合组MMSE评分高于磁刺激组，UPDRSⅠ-Ⅲ评分、中医证候积分低于磁刺激组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 两组MMSE评分、UPDRS评分、中医证候积分比较(±s)单位：分

2.6 两组临床疗效比较 与磁刺激组比较，联合组的总有效率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表6。

表6 两组临床疗效比较

3 讨 论

帕金森为一种以肌肉僵直、静止性震颤、运动减少为主要特征的慢性中枢神经系统神经退行性疾病。重复经颅磁刺激疗法可经刺激病人病灶部位，利用脉冲磁场作用于脑组织，诱发一定强度的感生电流，使得神经细胞去极化，进而诱发电位，调节病人大脑皮层的兴奋性，促进疾病恢复，是一种耐受性良好、非侵入性的治疗手段[10-11]。临床研究显示，在重复经颅磁刺激的作用下，特殊的波形可直接刺激病人下丘脑、大脑，促使其释放5-HT、NE、DA等神经递质，改善神经病变，修复神经损伤[12-13]。但随着重复经颅磁刺激疗法的应用，发现单纯应用此种疗法效果不理想[14]。中医学上认为帕金森属于“震颤”“颤证”“肝风”等范畴，认为此病的病位在脑，与肝、肾密切相关，针灸是中医常用的治疗手段，针对病人疾病特征选取特定的穴位进行针灸治疗，可改善疾病症状[15]。本研究选择颅底七穴联合应用针刺、重复经颅磁刺激疗法对帕金森病病人进行治疗。颅底七穴分布在督脉、足太阳膀胱经、足少阳胆经，均属于阳经，分布于头颅底部，顺次排开，七穴相连，共同形成了帕金森病的颅底治疗带，较易直达病所，结果发现，病人脑波明显改善，且神经递质含量明显增加，提示两者共同刺激病灶，促进神经递质的分泌、修复损伤。

Hcy是一种蛋氨酸代谢产物，与机体的能量代谢有关，参与神经变性疾病的发生发展，在帕金森病病人中异常升高，表明病人机体能量代谢处于失衡状态[16]。CysC是神经系统疾病诊治的敏感指标，帕金森病发生后其含量增高[17]。本研究发现，联合治疗组采用针灸、重复经颅磁刺激疗法，Hcy、CysC水平均明显降低，表明两者联合治疗帕金森有效。miRNA是一类位于人类19～23号染色体上的非编码RNA，可特异性结合mRNA分子3′端非编码区域序列，抑制靶mRNA翻译和降解靶mRNA，参与神经系统疾病的发生，参与细胞增殖、凋亡、分化等过程，与心血管疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤的发生相关[18]。另外，研究显示，在神经组织中所表达的miRNA具有明显的组织特异性，当其过度表达或者缺失时，会导致相应神经退行性疾病的发生，并促进疾病进展[19]。临床研究发现，帕金森病的发生与α-synuclein异常聚集所致的多巴胺神经元凋亡相关，而miR-214参与α-synuclein异常聚集过程，miR-214在帕金森病中处于较高水平[20-21]。miR-103a以GRCh38 p12为前体，经一系列的加工修饰而形成，参与多种神经中枢疾病的发生，包括精神分裂症、帕金森病等，在上述病人机体内含量明显升高[22]。本研究结果发现，针刺、重复经颅磁刺激疗法可明显抑制miR-214、miR-103a异常表达，提示两者联合具有抑制多巴胺神经元凋亡、抑制中枢神经病变进展的作用。

研究指出，帕金森病的发生和发展与线粒体的功能缺陷、泛酸蛋白酶体功能异常、氧化应激、遗传因素、环境因素、年龄因素等密切相关[23]。该疾病的发生会造成病人出现运动迟缓、僵直、认知功能损害、运动受限以及便秘等症状，治疗过程中则需要平衡病人泛酸蛋白酶体功能，以及脑内多巴胺的补充。本研究结果表明，针刺联合重复经颅磁刺激可使病人智力状态、生活质量等中医证候积分显著降低，可能与该联合方案能有效改善病人头部震颤、智力减退、颈部僵直、头晕头痛等症状有关。

综上所述，针刺联合重复经颅磁刺激疗法可明显改善帕金森病病人临床症状，改善miR-103a、miR-214异常表达，促进脑神经递质分泌。