急性心肌梗死病人入院血清miR-126、ADAM9水平与短期预后的相关性分析

陈 才，程景林，王 靓

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是急性冠脉综合征中最严重的类型，具有发病急、进展快、死亡风险高的特点，是心血管疾病中引起死亡的主要原因之一，早期快速地对急性心肌梗死病人进行危险分层，识别高危病人并采取合理的治疗措施对改善病人预后、提高生存率具有重要意义[1]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22 nt的非编码RNA，通过结合特定mRNA的3′UTR区使基因沉默，在平滑肌细胞增殖、血管新生、损伤修复等过程中发挥重要作用[2]，其中微小RNA-126(microRNA-126，miR-126)可多基因靶向调控血管再生，同时促进多种血管相关基因的表达与分泌，进而促进血管再生和成熟[3]。去整合素-金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是ADAM家族中重要的一员，广泛表达于哺乳动物的多种组织中，参与各种病理与生理学过程，参与炎症反应、病理性视网膜新生血管化、过敏反应和免疫性疾病的发生发展[4]。Suresh等[5]研究发现，与正常人相比，糖尿病病人心脏miR-126表达较低，并且ADAM9表达相应增加，可增强吞噬细胞清除凋亡细胞的胞吞作用，减轻心脏损伤后心肌缺血-再灌注损伤过程所致损害，以实现炎症和维持组织动态平衡。本研究通过观察急性心肌梗死病人入院血清中miR-126、ADAM9的表达水平，探讨急性心肌梗死病人入院血清miR-126、ADAM9表达水平对急性心肌梗死短期预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月—2019年6月在安徽医科大学第二附属医院急诊内科确诊并收治的急性心肌梗死病人142例为观察组，其中男73例，女69例，年龄42～70(56.41±7.04)岁；选取同期体检健康者140名作为对照组，其中男76名，女64名，年龄42～71(57.16±7.53)岁。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①符合世界卫生组织(WHO)心肌梗死诊断和治疗指南制定的标准[6]；②治疗前1个月未接受重大手术者；③胸痛症状持续>20 min，服用硝酸酯类药物无效。排除标准：①严重心、肝、肾功能障碍；②曾行冠状动脉支架置入术等心脏手术者；③合并各种恶性肿瘤者；④近2周内服用糖皮质激素药物者；⑤凝血功能障碍者。

1.3 主要试剂与仪器 转录试剂盒(货号：DEM201-20T购自北京拜尔迪生物技术有限公司)；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(货号：RR037A)及TRIzol试剂(货号：JMS12279)均购自日本TaKaRa公司；人ADAM9酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(货号：JH-H11066)购自上海继和生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：MiniAmp)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 临床资料收集 入院时收集纳入者性别、年龄、基本疾病情况等一般资料。

1.4.2 血清样本的采集与保存 观察组病人在急性心肌梗死发病后0～12 h、对照组于常规体检当日采集外周静脉血5 mL，且观察组于1个月复查时再次进行血样采集，操作人员及方法与第1次样本采集保持一致。所有血样于3 500 r/min离心10 min，吸取上清液2 mL于试管中，保存于-80 ℃冰箱内待测。

1.4.3 qRT-PCR测定血清miR-126表达水平 从-80 ℃取出血清样本，按试剂盒说明书提取血清总核糖核酸(RNA)。异丙醇沉淀浓缩后，用75%乙醇洗涤，干燥后加入100 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水，检测所得RNA纯度及完整度；按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)，产物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反应(反应体系15 μL)：cDNA(50 ng/μL)模板1 μL，缓冲液3 μL，10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.5 μL，正、反向引物各1 μL，1.5 U Taq酶0.5 μL，水8 μL。每个样本设置3个平行。正、反向引物及内参基因由上海恒斐生物科技有限公司设计并合成，miR-126以U6为内参，ADAM9以β-actin为内参，引物序列见表1。反应条件：92 ℃预变性14 min；91 ℃变性35 s，59 ℃退火30 s，74 ℃延伸16 s，45个循环，每个循环72 ℃收集荧光。采用2-ΔΔCt法计算血清中miR-126的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.4 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清中ADAM9的表达水平 从-80 ℃冰箱中取出血清标本，利用ELISA测定血清ADAM9表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 随访结果 随访时间开始于病人治疗结束出院当日，随访时长为1个月，采用电话、微信等方式记录病人生活质量及死亡情况。1个月后观察组复查心脏彩超，根据其是否发生不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACEs)分为MACEs组(36例)、未发生MACEs组(106例)。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组年龄、性别、糖尿病史占比、高脂血症占比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，观察组高血压比例、体质指数(BMI)高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组血清miR-126、ADAM9表达水平比较 观察组血清中miR-126表达水平低于对照组，ADAM9表达水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组血清中miR-126、ADAM9表达水平比较(±s)

2.3 观察组血清miR-126、ADAM9表达水平的相关性 观察组病人血清中miR-126与ADAM9表达水平呈负相关(r=-0.580，P<0.001)。详见图1。

图1 观察组血清miR-126、ADAM9表达水平的相关性

2.4 MACEs组与未发生MACEs组血清miR-126、ADAM9表达水平比较 MACEs组血清中miR-126表达水平低于未发生MACEs组，ADAM9表达水平高于未发生MACEs组(P<0.05)。详见表4。

表4 MACEs组与未发生MACEs组血清miR-126、ADAM9表达水平比较(±s)

与未发生MACEs组比较，①P<0.05。

2.5 血清miR-126、ADAM9表达水平对急性心肌梗死病人发生MACEs的预测价值 ROC曲线显示，miR-126预测急性心肌梗死病人发生MACEs的ROC曲线下面积为0.757[95%CI(0.675，0.839)]，截断值为0.884，敏感度为94.4%，特异性为47.2%；ADAM9预测急性心肌梗死病人发生MACEs的ROC曲线下面积为0.681[95%CI(0.572，0.790)]，截断值为1.732 pg/mL，敏感度为44.4%，特异性为90.4%；miR-126、ADAM9联合预测急性心肌梗死病人发生MACEs的ROC曲线下面积为0.786[95%CI(0.700，0.873)]，敏感度为86.1%，特异性为77.9%。详见图2。

图2 血清miR-126、ADAM9表达水平对急性心肌梗死病人发生MACEs的预测价值

3 讨 论

急性心肌梗死是冠心病中最为严重的一种类型，具有较高的死亡率，急性心肌梗死病人在接受介入治疗时会出现心肌缺血-再灌注损伤，目前认为急性心肌梗死发病越久，血管再通难度越大，黄明剑等[7]研究显示，>6～12 h组血清N末端B型利钠肽前体(NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白I (cTnI)水平明显低于>3～6 h组和≤3 h组，发病>6～12 h行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)，虽然病人心功能恢复更好，但左室射血分数(LVEF)更低，心肌损伤程度更大，不利于病人预后；≤3 h组再灌注心律失常发生率明显高于>3～6 h组和>6～12 h组，提示越早开通梗死相关动脉再灌注心律失常发生率越高。因此，急性心肌梗死发病3～6 h是急诊经皮冠状动脉介入治疗的最佳时间窗，尽早开通梗死相关动脉，恢复冠状动脉供血，是拯救濒死心肌、提高左室功能、改善病人预后的重要措施。宫俊龙[8]的研究显示，高血压是冠心病的主要危险因素之一，在高血压合并急性心肌梗死病人中，血压变异性与冠状动脉病变程度相关。焦震宇等[9]等的研究显示，年龄、BMI等是空腹三酰甘油水平升高人群发生急性心肌梗死的危险因素。本研究结果中，两组基线比较，观察组高血压比例、BMI高于对照组，说明高血压、肥胖与急性心肌梗死发生具有一定相关性。miRNA在心肌细胞中表达丰富，参与心肌细胞凋亡、心律失常、心肌肥厚、心室重构和心力衰竭等病理生理过程[10]。其中miR-126广泛存在于内皮细胞(endothelial cells，EC)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)中，是血管生成的主要调节剂，具有保护血管和抗动脉硬化的作用[11]。研究显示，在非冠心病、心绞痛和心肌梗死3组中，病人血浆miR-126水平呈递降趋势，即miR-126水平随冠心病严重程度增加而降低，提示其表达水平可能与心肌损伤程度有关[12]。Chistiakov等[13]研究发现，在成熟的EC和成人EPC中，miR-126通过抑制血管生成、维持血管完整性、增加相关静态内皮表型抑制细胞的增殖和运动，从而促进血管稳态。本研究结果中，观察组血清miR-126表达水平低于对照组，MACEs组血清miR-126可能表达水平低于未发生MACEs组，提示miR-126可能参与急性心肌梗死病人的发病过程。短期预后过程中，发生MACEs的病人miR-126表达水平依然低于未发生MACEs的病人，猜测miR-126表达降低可能是由于急性心肌梗死过程中血管梗死，miR-126保护血管的作用被抑制，血管稳态破坏，而miR-126表达降低又使得这种情况持续至病人抢救后的恢复状态，从而导致病人发生MACEs，形成恶性循环。

ADAM9是ADAM的家族成员，除了金属蛋白酶活性，ADAM9还与不同的整合素相互作用，调节细胞黏附功能，例如ADAM9 Disintegrin域可通过与整合素相互作用，激活人体中性粒细胞[14]。可溶性ADAM9细胞外域不能增加内皮细胞单层通透性或抑制单核细胞-内皮黏附，但可以抑制单核细胞-内皮迁移[15]。单核细胞进入血管内膜后，分化成巨噬细胞，摄取修饰后的脂蛋白成为泡沫细胞，逐渐积累在内皮的泡沫细胞凋亡，若凋亡的泡沫细胞没有被及时清除，可逐渐导致血栓和炎性坏死核心的形成，巨噬细胞进一步加剧炎症，继发血栓形成，引起缺血性事件如心肌梗死[16]。本研究结果显示，观察组血清中ADAM9表达水平高于对照组，MACEs组血清中ADAM9表达水平高于未发生MACEs组，提示ADAM9参与急性心肌梗死的发生过程，ADAM9对急性心肌梗死发生的作用机制可能是ADAM9高表达抑制单核细胞向内皮迁移，防止分化为泡沫细胞导致血栓的形成，ADAM9或与急性心肌梗死发生时所引起的炎性机制相关；而在病人短期恢复期间，巨噬细胞持续作用于心肌再灌注所引起的修复过程中，导致ADAM9保持高表达的同时激活中性粒细胞分泌。另外Pearson分析结果显示，观察组病人血清中miR-126与ADAM9表达水平呈负相关。ROC曲线显示，miR-126预测急性心肌梗死病人发生MACEs的ROC曲线下面积为0.757，截断值为0.884，但特异性较低；ADAM9预测急性心肌梗死病人发生MACEs的ROC曲线下面积为0.681，截断值为1.732 pg/mL，敏感度较低，提示当miR-126相对表达量低于0.884、ADAM9相对表达量高于1.732 pg/mL时，心肌梗死病人可能发生MACEs；miR-126、ADAM9联合预测急性心肌梗死病人发生MACEs的敏感度为86.1%，特异性为77.9%，比单项检测miR-126、ADAM9敏感度、特异性均高，因此miR-126、ADAM9血清表达量对急性心肌梗死病人发生MACEs的预测有一定的价值，联合检测价值更高。

综上所述，急性心肌梗死病人血清中miR-126呈低表达，ADAM9呈高表达，且两者表达呈负相关，miR-126、ADAM9血清表达对急性心肌梗死病人是否发生MACEs的预测有一定的价值。