收获期对高水分玉米籽粒湿贮品质及真菌毒素的影响

王兴亚，张守梅，郭玉秋，张娜娜，陈利容，龚魁杰，刘开昌

（1.山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院，山东 济南 250100）

玉米收获时籽粒含水量较高，一般在30%以上［1］，若直接脱粒胚部种皮易碎，为霉菌提供营养，入仓后存在存贮变质、毒素滋生、营养下降等诸多问题。为了降低籽粒含水量，玉米需要晾晒、烘干等环节，但成本较高［2］。因此，探索一种简单、经济、有效的贮藏方法是解决这些问题的关键所在。有研究表明，玉米籽粒湿贮能够更好地贮存，防止发霉变质，保持营养成分，减少浪费，降低饲料成本，提高养殖户的经济效益［3］。

以往针对全株玉米青贮的研究表明，收获期会影响青贮饲料的霉菌毒素、营养价值及发酵品质等［4-6］。过早收获成熟度相对较低，玉米淀粉含量低，造成产量以及青贮饲料能值较低［7］。同时，容易造成梭菌繁殖，影响青贮品质［8］。收获推后可以保证最佳的产量和营养价值［9］，但是真菌数量和真菌毒素含量随着收获期的延后而增加［10］。而且，收获较晚会导致淀粉比例较高，难以实现高紧实度的青贮，限制乳酸菌的生长，青贮效果较差［11］。因此，适宜的收获期是发酵的关键。

目前关于收获期对玉米饲料发酵效果的研究主要集中在全株玉米和玉米秸秆，缺乏对玉米籽粒湿贮的研究。因此，本研究通过设置不同玉米籽粒收获期，从霉菌毒素（呕吐毒素）、营养价值、发酵品质方面探索最适玉米籽粒湿贮收获期，以期为玉米籽粒湿贮的发展提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 湿贮玉米籽粒采集

湿贮玉米籽粒选用京农科728（JNK728）品种籽粒。2020年6月25日播种于山东省农业科学院济阳实验基地（117.22°E，36.98°N），10月15日收获。

1.2 试验设计

试验共设3个处理，即分别在籽粒含水量20%～30%、30%～40%和40%～50%时收获玉米并破碎，继而采用厌氧发酵袋发酵，重复3次。玉米籽粒含水量用谷物水分测定仪测定。分别在湿贮前和湿贮后10、20、30、90 d取样测定相关指标。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 真菌分离、纯化和鉴定 称取5 g样品于含有45 mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，密封后置于智能恒温培养振荡器（HNY-100B，天津欧诺仪器股份有限公司）中150 r/min振荡20 min，静置5 min后，取1 mL上清液于装有9 mL灭菌蒸馏水的离心管中，混匀后依次稀释成10-2、10-3、10-4浓度梯度。取100μL稀释液涂布于含有1%青霉素（10000 U/mL，）和硫酸链霉素（10 mg/mL）的PDA培养基上，每个浓度梯度设置3个重复。室温下培养3～5 d，根据菌落形态进行计数和编号，并纯化至单一菌落，用无菌保种管4℃保存。

将分离纯化的菌落接种于PDA培养基上，室温下培养3～5 d，待菌落直径扩展到3～5 cm时，测量菌落大小，测定气生菌丝状态、菌落颜色和纹理形态以及是否产生可溶性色素等。在超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）上用无菌接种针挑取少量菌丝至滴有无菌水的载玻片上，于光学显微镜（IX51，日本OLYMPUS公司）下观察菌丝和孢子形态。

根据观察结果，选取不同形态的菌株，采用热裂解法［12］进行真菌DNA组提取。采用基于18S核糖体DNA的ITS通用引物进行DNA片段扩增［13］。

1.3.2 呕吐毒素测定 呕吐毒素采用酶联免疫吸 附 法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定，按照试剂盒上的说明书逐步加样进行反应。利用酶标仪（GENIOS Plus，瑞士TECAN公司）在450 nm和630 nm双波长下检测样品反应，读取各孔的吸光度值，计算百分吸光率。其公式如下：

式中，B为标准品或样品的吸光度值，B0为空白对照吸光度值。

以标准品百分吸光率为纵坐标，以对应毒素标准品浓度（μg/kg）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。根据标准曲线，计算样品呕吐毒素含量。

1.3.3 营养价值指标测定 干物质（DM）和粗灰分（Ash）含量测定参考《饲料分析及饲料质量检测技术》［14］进行测定。粗蛋白质（CP）含量测定采用凯氏定氮法。淀粉含量测定采用蒽酮比色法。

1.3.4 发酵指标测定 称取20 g样品，加入180 mL无菌蒸馏水，用榨汁机榨汁后过滤，取滤液用于发酵指标测定。使用pH计（LE438，METTLER TOLEDO）测定pH值。取滤液8 mL于10 mL离心管中，加入25%偏磷酸1.6 mL，置于-4℃冰箱过夜，10000 r/min离心，取上清液，于0.45μm孔径水相滤膜下过滤用于指标测定。其中，乳酸含量采用对羟基联苯比色法测定，氨态氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。费氏评分（FS）采用王国艮［8］的方法进行，计算公式：

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，显著水平设置为0.05，采用最小显著法（LSD法）进行。SigmaPlot 10.0作图。测序结果用Chromas软件进行序列分析和校正，在Genebank中进行在线比对，获得较高同源性的核苷酸序列，再初步确定其发育地位。

2 结果与分析

2.1 不同收获期对玉米籽粒湿贮真菌数量的影响

玉米籽粒湿贮前，分离出的霉菌种类主要为镰刀菌属Fusarium、曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium。随着收获期的推迟，霉菌数量增加。玉米籽粒湿贮能明显降低霉菌数量。发酵30 d，除20%～30%籽粒含水量下霉菌数量降低94.8%外，其余处理霉菌数量均降低100%，即降至零。发酵过程中，分离出的酵母菌以毕赤酵母Pichia kudriavzevii为主，酵母菌数量呈现先增加后减少趋势，20%～30%籽粒含水量下酵母菌较活跃（表1）。

表1 不同收获期玉米籽粒湿贮真菌数量变化

2.2 不同收获期对玉米籽粒湿贮呕吐毒素含量的影响

由图1可知，收获期对玉米籽粒呕吐毒素含量有显著影响。湿贮前，20%～30%含水量下籽粒呕吐毒素含量为325.4μg/kg，显著高于其它两个处理。其它处理籽粒呕吐毒素含量均较低，在1.5～31.5μg/kg之间。玉米籽粒湿贮能显著降低呕吐毒素含量。发酵10 d，20%～30%含水量下籽粒呕吐毒素含量降低91%，降至30.5μg/kg。发酵90 d，各处理籽粒呕吐毒素含量在1.7～32.3 μg/kg之间，均低于中国饲料卫生标准中植物性饲料原料的最高限量5 mg/kg（GB 13078—2017）。

图1 不同收获期玉米籽粒湿贮呕吐毒素含量变化（干基）

2.3 不同收获期对玉米籽粒湿贮营养品质的影响

由表2可以看出，不同收获期玉米籽粒的干物质、粗灰分、蛋白质和淀粉含量均存在明显差异。随着收获期推迟，籽粒干物质、蛋白质含量显著增加（P＜0.05），粗灰分含量降低；20%～30%含水量下籽粒淀粉含量显著高于其它两个处理。

表2 不同收获期玉米籽粒湿贮营养品质变化（干基） （%）

随着发酵时间延长，相同含水量下籽粒干物质无明显变化；30%～40%和40%～50%含水量下粗灰分含量降低，20%～30%含水量下粗灰分含量增加；发酵30 d，蛋白质含量明显增加；淀粉含量呈现先增加后降低趋势。

2.4 不同收获期对玉米籽粒湿贮发酵品质的影响

由表3看出，湿贮前，20%～30%含水量下pH值显著低于其它两个处理，40%～50%含水量下NH3-N含量显著低于其它两处理（P＜0.05）。

表3 不同收获期玉米籽粒青贮发酵品质变化（干基）

随着发酵时间延长，各处理玉米籽粒pH值整体呈降低趋势，高水分含量下pH值降速较快。发酵30 d，除20%～30%含水量外，其它两处理pH值均降至4.3以下；发酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍为4.71。发酵90d，30%～40%和40%～50%含水量下乳酸和NH3-N含量显著高于20%～30%含水量（P＜0.05）。发酵30 d和90 d，30%～40%含水量下费氏评分最高。

3 讨论与结论

3.1 不同收获期对玉米籽粒湿贮真菌及呕吐毒素的影响

本研究中，随着收获期推迟，霉菌数量以及呕吐毒素含量均增加。主要是因为作物生育后期，随着收获期推迟，真菌感染、生长以及毒素积累的风险 将 会 增 加［10，15］。本 研 究 中，发 酵30 d，20%～30%含水量下霉菌数量降低94.8%，其它两处理均降低100%，即降至零，这可能是乳酸菌在发挥作用。因为发酵过程中起主导作用的是乳酸菌，乳酸菌通过产生乳酸使湿贮玉米籽粒变为酸性，逐渐形成不利于腐败菌生长的条件［16］。但是，收获期会影响发酵过程中的乳酸菌生长，含水量较低时乳酸菌生长受到抑制，而此时酵母菌与乳酸菌争夺糖分，快速繁殖［17］。因此，20%～30%含水量下酵母菌含量较高。本研究中，发酵10 d，20%～30%含水量下呕吐毒素含量降低91%。有研究表明，乳酸菌和酵母菌均可以结合或降解发酵饲料中的霉菌毒素，使湿贮过程中真菌毒素含量下降［18］。但是，呕吐毒素下降的具体原因以及机理还需要进一步探索。

3.2 不同收获期对玉米籽粒湿贮营养品质的影响

随着收获期的改变，玉米籽粒的营养成分也发生差异性变化［19］。本研究中，随着收获期推迟，玉米籽粒湿贮前后均表现为干物质、蛋白质和淀粉三者含量增加。这和以往研究结果一致［20］。因为籽粒形成期叶片光合产物和茎叶中贮存的干物质集中向籽粒转运，籽粒干物质量逐渐增加，其淀粉和蛋白质含量也均在蜡熟后期至成熟阶段呈现最大值。

3.3 不同收获期对玉米籽粒湿贮发酵品质的影响

研究表明，收获期对玉米籽粒湿贮具有显著影响，过低的籽粒含水量不利于发酵［21］。本研究中，发酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍为4.71，未达到发酵要求标准，并且其乳酸和NH3-N含量显著低于高含水量处理。主要是因为适宜的水分是乳酸菌生长发酵的必要条件，较高水分含量乳酸菌比较活跃，而水分含量低会使物料难以压实，乳酸菌发酵缓慢，产酸较少，pH值也降低的相对缓慢［19］。微生物的蛋白质水解过程会影响发酵玉米的NH3-N含量，高水分玉米由于发酵比较活跃，因此NH3-N含量高，这与Schmidt等（2009）［22］的研究结果一致。费氏评分主要由干物质含量和pH值计算得到，是评估发酵效果的标准之一［5］。本研究中，30%～40%含水量下费氏评分最高，与20%～30%含水量相比，其pH值降速较快，pH值较低，同时干物质含量高于40%～50%含水量处理。

综上所述，湿贮玉米籽粒最佳收获期为含水量30%～40%。