响应面法优化山楂果肉总黄酮闪式提取研究

赵成萍，陈胜萍，刘晓光，王文斌

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.唐山市农业科学研究院，河北 唐山 063001）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）属于蔷薇科，为中国传统食、药材［1］，含有黄酮类、三萜类、有机酸、维生素C、无机盐等化学成分［2］，具有抗血小板聚集、增强免疫力、抗氧化、镇静、抗菌、利尿等药理作用［3，4］。黄酮类化合物可调节脂质代谢并降低血清胆固醇，改善血液循环，具有降压作用［5-8］，以黄酮类化合物为基础的研究已受到广泛关注［9］。

关于山楂黄酮提取方法的研究报道较多［10］，常见的有溶剂浸提、超临界萃取、超声波辅助提取等。溶剂浸提法［11］分离效果差，效率低；超临界萃取法［12］对温度要求严格，安全性不足；超声波辅助提取法［13］操作流程复杂，用时较长，应用范围有限，提取率低。闪式提取法利用机械剪切刀，在高速电机作用下切割搅拌振动材料，通过真空负压使其化学成分充分溶解，当植物有效成分在短时间内达到动态平衡后，通过过滤提取总黄酮。闪式提取具有用时短、效率高、适用范围广、操作简单易行、使用安全可靠等优点，且在室温下即可进行提取，能够保护提取物质中的热敏性成分［14］。

响应面法（RSM）利用试验获得数据构建多元二次回归方程，建立响应面回归模型，通过对各因素分析得到最优工艺参数。相对于正交设计方法，响应面法预测性更好、方便简单、节约资源，对于工艺优化非常有效［15，16］。

本研究选取液料比、提取时间、乙醇浓度三个单因素进行山楂果肉总黄酮闪式提取试验，利用响应面法建立模型优化提取工艺，提高总黄酮得率，以期为开发山楂果肉中总黄酮药用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试山楂品种为‘歪把红’，鲜果取自山西省太谷县三台村。该品种果实圆形，色泽鲜红，果肉粉红，质地松软，风味优异，总糖含量6.21%，可滴定酸含量2.44%，维生素C含量5.38 mg·kg-1，黄酮含量10.42 mg·kg-1。将新鲜山楂洗净，去核，放入干燥箱中60℃恒温烘干至恒重，然后粉碎机粉碎，过80目筛，储存于干燥瓶中，4℃冰箱密封保存备用。

芦丁标准品购自国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯，购自天津市天力化学试剂有限公司。索氏提取器由上海争巧科学仪器有限公司生产；SBZ-019型中草药粉碎机由天津泰斯特生产；JHBE-50T中草药闪式提取器由河南智晶生物科技股份有限公司生产；7200型紫外可见分光光度计由尤尼克（上海）仪器有限公司生产；CSIOII型电热鼓风干燥箱由重庆试验设备厂生产；抽滤真空泵由郑州市亚荣仪器有限公司生产。

1.2 建立芦丁标准曲线

用60%乙醇溶液溶解芦丁标准品，得到0.2 mg·mL-1芦丁标准溶液。将0、1、2、3、4、5 mL标准溶液分别转移到25 mL容量瓶中，先后加入5%亚硝酸钠溶液和10%硝酸铝溶液各0.3 mL，振荡并摇匀，静置6 min后，加入1 mol·mL-1的氢氧化钠溶液4 mL，振荡摇匀，用60%乙醇溶液定容。测定510 nm处的吸光度，建立芦丁标准曲线［17］。

1.3 总黄酮提取及含量测定

采用硝酸铝显色法。称量山楂果肉粉200 g于蓝盖瓶中，分别在不同液料比、乙醇浓度、提取时间条件下进行闪式提取。将提取液移至离心杯中，然后5000 r·min-1离心15 min，取上清液4 mL于25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后静置6 min；加10%硝酸铝溶液0.3 mL，振荡摇匀静置6 min；加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液4 mL，振荡摇匀，最后用60%乙醇溶液定容后静置15 min，测510 nm处的吸光度［18］。以芦丁作参照物计算山楂果肉总黄酮含量，按下式求出总黄酮的提取率E。

式中，C为提取液中黄酮质量浓度（g·mL-1）；V为提取液体积（mL）；n为提取液稀释倍数；m为称取的山楂果肉粉末的质量（g）；E为总提取率（%）。

1.4 单因素试验

在电压100 V，时间60 s，乙醇体积浓度（以下简称乙醇浓度）70%条件下，设置5个液料比（乙醇/山楂果肉粉，mL/g）水平（20、30、40、50、60）；在电压100 V，液料比40，乙醇浓度70%条件下，设置5个提取时间（s）水平（60、70、80、90、100）；在电压100 V，时间60 s，液料比40条件下，设置5个乙醇浓度（%）水平（40、50、60、70、80）。3次重复，计算山楂果肉总黄酮提取率。

采用Microsoft Excel及SPSS 17.0软件进行标准差计算及显著性差异分析。

1.5 响应面试验

以单因素试验为基础，以液料比（30、40、50）、乙醇浓度（50%、60%、70%）、提取时间（60、70、80 s）3个因素为自变量，以山楂果肉总黄酮提取率为因变量设计响应面试验，分析多因素交互作用，优化提取条件，最后使用Design Expert 8.0.5软件对3个因素进行中心组合设计［19］。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

如图1所示，因变量y为吸光度，自变量x为芦丁质量浓度（mg·mL-1），芦丁标准曲线的回归方程为y=8.7312x-0.0089，相关系数R2=0.9997，线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素对总黄酮提取率的影响

2.2.1 液料比对总黄酮提取率的影响 由图2可看出，在电压、时间、乙醇浓度一定的条件下，不同液料比与山楂果肉总黄酮提取率间关系呈单峰曲线，并在液料比40时达到峰值。因此，山楂果肉总黄酮闪式提取最佳液料比为40。

图2 液料比与总黄酮提取率关系

2.2.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 由图3可知，在电压、提取时间、液料比一定的条件下，乙醇浓度在40%～60%之间与总黄酮提取率呈线性正相关，并在60%时达到峰值，乙醇浓度高于60%提取率呈明显下降趋势。由此确定60%是山楂果肉总黄酮闪式提取的最佳乙醇浓度。

图3 乙醇浓度与总黄酮提取率关系

2.2.3 提取时间对总黄酮提取率的影响 如图4所示，在电压、乙醇浓度、液料比一定的条件下，在60～70 s区间，山楂果肉总黄酮提取率上升，70 s时达到峰值，之后提取率急剧下降，在80～100 s区间下降平缓。由此确定70 s是山楂果肉总黄酮闪式提取的最佳时长。

图4 提取时间与总黄酮提取率关系

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面法试验结果 响应面设计不同因素及水平组合条件下的山楂果肉总黄酮提取率见表1，在提取时间70 s、乙醇浓度60%、液料比40时，山楂果肉总黄酮提取率最高，为13.746%。

表1 响应面法试验设计及结果

2.3.2 山楂果肉总黄酮提取率回归模型的建立及显著性检验 使用Design Expert 8.0.5软件对表1数据进行回归分析，建立3个因素与山楂果肉总黄酮提取率Y的二次回归方程：

方差分析结果（表2）表明，模型显著，失拟项不显著，说明试验误差小；决定系数达0.9以上，说明模型具有较高的拟合度，可用于山楂果肉提取总黄酮的条件优化。

表2 回归模型显著性检验和方差分析结果

回归模型显著性检验结果（表2）表明，模型中一次项A（P=0.4241）、B（P=0.6980）、C（P=0.3181）均不显著，表明液料比、提取时间、乙醇浓度单因素对山楂果肉总黄酮的提取效果影响不显著；二次项B2（P=0.0048）、C2（P=0.0091）表现为极显著，A2（P=0.0309）表现为显著，说明乙醇浓度、液料比、提取时间对山楂果肉总黄酮提取率的影响是较为复杂的二次关系，影响顺序为液料比＞提取时间＞乙醇浓度。

2.4 多因素交互作用响应面分析

由图5可知，在液料比或乙醇浓度一定的条件下，总黄酮提取率均随着另一个因素的增大而先升后降。乙醇浓度与料液比的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用显著。从响应面图可知，液料比与乙醇浓度的曲线较陡，说明总黄酮提取率受两者的交互作用影响较大。

图5 液料比与乙醇浓度对山楂果肉总黄酮提取率交互影响的等高线图和响应面图

由图6可知，固定液料比或提取时间，总黄酮提取率都随着另一个因素的增大而先升后降，且液料比和提取时间的等高线形状偏圆形，说明两者交互作用较缓和。从响应面图可知，液料比的曲线平缓，提取时间曲线较陡，表明两者交互作用对总黄酮提取率有一定影响。

图6 液料比与提取时间对山楂果肉总黄酮提取率交互影响的等高线图和响应面图

由图7可知，固定乙醇浓度或提取时间，总黄酮提取率都随着另一个因素的增大而先升后降。乙醇浓度和提取时间等高线呈椭圆形，表明两者交互作用显著。从响应面图可以看出，乙醇浓度的曲线平缓，提取时间曲线较陡，两者交互作用对总黄酮提取率影响较大。

图7 乙醇浓度与提取时间对山楂果肉总黄酮提取率交互影响的等高线图和响应面图

2.5 山楂果肉总黄酮最佳提取参数确定及验证试验分析

通过分析回归方程，对提取率选择Maximize模式进行优化，得到山楂果肉总黄酮最优提取参数：提取时间74.49 s、乙醇浓度65.88%、液料比44.49，此时，山楂果肉总黄酮提取率理论值为13.2767%。

为验证回归方程，设置提取时间74 s、乙醇浓度66%、液料比44，进行山楂果肉总黄酮提取率实测试验，结果总黄酮提取率为13.3045%，与理论预测值基本一致，说明采用响应面法优化设计的回归方程可以较好地反映各个因素之间的交互作用及其对山楂果肉总黄酮提取率的影响。

3 小结

据文献报道，一般山楂鲜果（如‘超金星’‘晋甜红’‘大绵球’）果肉黄酮含量在4～6 mg·kg-1之间［19，20］，不同山楂总黄酮提取工艺的黄酮得率在0.5%～10%之间［13，21，22］。本试验采用闪式提取法进行山楂果肉总黄酮的提取，并利用响应面法对各提取参数进行优化，结果表明在提取时间74 s、乙醇浓度66%、液料比44条件下，总黄酮提取率达到13.3045%。可见，闪式提取法提取时间短、乙醇用量少，可在室温下进行，能耗及成本更低，而且总黄酮提取率更高。本研究结果最大程度提高了山楂果肉总黄酮提取率，对提升山楂果肉资源的开发与利用具有实际指导意义。