白血病与骨髓增生异常综合征患者Th17、白细胞介素21及白细胞介素1β水平变化研究

马 兵，张丽红，赵 丹，李月贤，尹婉宜，沈 扬

河北医科大学第一医院 血液内科，河北 石家庄 050031

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)为临床常见的血液系统疾病，尽管疾病的性质不尽相同，但均可引发骨髓造血衰竭[1]。MDS是一组起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，环孢素和抗胸腺细胞球蛋白等免疫抑制剂对30%～60%患者治疗有效[2]。AML也属于造血干细胞/祖细胞恶性克隆性疾病，但其仅可通过放疗/化疗产生疗效[3]。目前，临床对于AML、MDS的免疫系统变化，T淋巴细胞介导的细胞免疫是否具有差异，以及AML与MDS为不同分期还是同一种疾病仍缺乏权威性的说明。Th17是一群在白细胞介素(interleukin，IL)-6等细胞因子和TCR通路刺激下分化的细胞亚群。Treg细胞是一种细胞群，可以对机体细胞免疫进行调控，维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体维持良好的免疫稳态[4]。有研究报道，Treg细胞和Th17细胞的平衡在同种异体胎儿免疫、器官移植、肿瘤及感染等疾病方面对各种途径的病理生理免疫应答具有一定的抑制作用[5]。本研究旨在探讨AML、MDS患者Th17、IL-21及IL-1β水平变化及临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将自2016年1月至2020年12月河北医科大学第一医院收治的20例AML患者纳入AML组，30例MDS患者纳入MDS组。将MDS组中难治性贫血原始细胞增多(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia with excessblasts，MDS-RAEB)患者纳入MDS-RAEB亚组(n=15)，难治性贫血(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia，MDS-RA)患者纳入MDS-RA亚组(n=15)。患者均符合相关血液病的诊断标准[6-7]，且排除心肝肾功能障碍者，排除恶性肿瘤及严重器质性消耗性疾病者。另选取同期于我院体检的20例健康者纳入对照组。AML组中，男性13例，女性7例；年龄40～71岁，平均年龄(58.69±3.18)岁；平均病程(2.39±0.32)个月。MDS组中，男性17例，女性13例；年龄41～72岁，平均年龄(58.73±3.25)岁；平均病程(2.42±0.28)个月。对照组中，男性15例，女性5例；年龄39～70岁，平均年龄(58.65±3.21)岁。各组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血及骨髓单个核细胞提取 抽取研究对象3 ml骨髓及外周血样本，抗凝使用肝素，1 500 r/min条件下离心10 min，取上清。在含有淋巴细胞分离液的尖底离心管中沿壁将无菌管缓慢加入，保持两个界面相对清晰，离心后，将离心管取出。将界面层细胞(单个核细胞)使用吸管吸出，使用无菌生理盐水清洗2遍，离心收集单个核细胞，使用加有10%灭活胎牛血清、谷氨酞胺、即用型链霉素/青霉素混合液的RPMI-1640培养液重悬细胞进行计数，并将细胞浓度调整为1×107个/ml。

1.2.2 外周血及骨髓单个核细胞Treg细胞、Th17细胞检测 将2×106的骨髓单个核细胞悬液加入到24孔培养板中，每个孔中加入1 ml，再向其中加入2 nmol/ml的莫能菌素、1 ng/ml的离子霉素、20 ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯，置于培养箱中，在5% CO2、37℃条件下培养4 h。细胞收集后，将其分为实验管和对照管，加入CD4-FITC、CD3-APC抗体，避光孵育30 min。弃上清液，加入4%的多聚甲醛固定，室温条件下处理20 min，0.1%皂素穿膜10 min，弃上清液，每个管道留置200 μl的穿膜液重悬细胞。加入10 μl的IL-17PE抗体，同行对照中加入相应对照抗体，室温条件下孵育1 h。洗涤后，上流式细胞仪检测Th17细胞百分比。将1 ml含有2×106个/ml的骨髓单个核细胞悬液分为实验管和对照管。洗涤后细胞重悬于200 μl洗液中，加入CD127 Perep-cy5.5、CD25-FITC、CD4-PE，室温条件下孵育15 min，PBS洗液洗涤，对照管中加入相应对照抗体，4℃条件下孵育15 min，上流式细胞仪检测Treg细胞。

1.2.3 外周血IL-17、IL-21、IL-1β、转化生长因子-β水平测定 采用酶联免疫吸附法对血清IL-17、IL-21、IL-1β、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平进行测定，试剂盒购于武汉赛培生物，操作方法按照说明书执行。

2 结果

2.1 各组研究对象外周血单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例比较 与对照组比较，AML组和MDS组外周血单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例明显升高，且MDS组高于AML组，差异有统计学意义(P<0.05)。MDS-RA亚组外周血单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例高于MDS-RAEB亚组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组研究对象外周血单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例比较

2.2 各组研究对象骨髓单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例比较 与对照组比较，AML组和MDS组骨髓单个核细胞Treg、Th17细胞细胞比例明显升高，且MDS组高于AML组，差异有统计学意义(P<0.05)。MDS-RA亚组骨髓单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例高于MDS-RAEB亚组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组研究对象骨髓单个核细胞Treg细胞、Th17细胞比例比较

2.3 AML、MDS患者Th17细胞与Treg细胞相关性分析 Pearson相关性分析显示，AML、MDS患者Th17细胞与Treg细胞均呈现一定正相关(r=0.467、0.539，P<0.05)。

2.4 各组研究对象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平变化 与对照组比较，AML组和MDS组外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明显升高，且MDS组高于AML组，差异有统计学意义(P<0.05)。MDS-RA亚组外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明显高于MDS-RAEB亚组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组研究对象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平变化

3 讨论

人体正常机体活动需要各种免疫细胞(尤其是T淋巴细胞)平衡的维持，这种平衡一旦被打破，免疫功能抑制或者亢进，进而造成机体免疫疾病的发生[8]。CD4+T细胞亚群包括Th17、Th2、Th1及Treg细胞，其中Th17和Th1细胞具有明显的增加细胞凋亡和抗肿瘤的作用，而Treg细胞和Th2细胞的主要功能为免疫制剂[9]。Th17细胞可表达CCR6、CCR4、IL-12，孤独性受体γt也是Th17细胞的重要特异性转录因子，与信号转导和转录激活因子3相互协同，对IL-17的产生和Th17的分化产生刺激作用[10]。Treg细胞是一类具有独特负性调节作用的细胞，可表达生成Foxp3、CD3+、CD4+细胞，其中Foxp3对Treg细胞的功能维持及分化具有重要的作用[11]。正常生理条件下，TGF-β对初始的CD4+细胞产生影响，诱导其分化为调节性T细胞，同时在TGF-β和IL-6的共同刺激下，可分化生成Th17细胞[12]。在激活的神经突触细胞或者IL-6的存在下，Treg细胞可自身分化为Th17细胞，通过免疫调节网络对Th17/Treg细胞的动态平衡产生维持作用[13]。有研究报道，在自身免疫性疾病中，IL-17R与促炎因子IL-17特异性结合，从而对相关信号通路进行激活，对相关炎症因子及趋化因子的释放产生促进作用，扩大自身免疫性反应及炎症反应，使Th17细胞/Treg细胞平衡向Th17细胞偏移[14]，但其在AML及MDS疾病发展过程中发挥促进还是抑制作用尚无定论。Owattanapanich等[15]研究报道，与正常人相比，进展期胃癌患者外周血Th17细胞数量明显较高，且与临床病理分期存在一定的相关性。本研究结果显示，MDS组患者Th17细胞明显高于对照组及AML组，且随着病情的进展，其Th17细胞数量逐渐增加；相关性分析表明，AML、MDS患者Th17细胞与Treg细胞均呈现一定正相关(P<0.05)。Yuan等[16]研究报道，在MDS骨髓环境中，Th17细胞比例和Treg细胞比例及相应绝对数均呈现升高趋势，与本研究结果一致。Dostalova等[17]研究报道，肺癌中Treg细胞与Th17细胞均显著提高，且两者呈现一定相关性。Tsutsumi等[18]研究报道，宫颈癌患者中Treg细胞及Th17细胞均一定程度增加，两种细胞平衡被打破。上述研究证实，在外周血及骨髓微环境中，Th17细胞与Treg细胞均呈现一定的正相关性。

AML与MDS之间的关系倾向于量变引发的疾病发展，而非质变引发的疾病转化。Britt等[19]研究报道，晚期MDS患者体内骨髓组织中IL-22、IL-21、IL-17呈现高水平表达，提示体内的Treg细胞逐渐向Th17细胞转化。而本研究结果显示，MDS患者血清IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21水平明显高于对照组及AML组，且随着MDS病情的发展，上述指标水平越高。其中，Treg细胞分泌的IL-1β、TGF-β呈现高水平表达，提示患者机体免疫耐受性相对增加。此外，IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21均可以促进Th17细胞的不断分化及扩增。在卵巢癌、宫颈癌等肿瘤研究中已经证实，IL-17可以通过对新生血管形成产生刺激作用，从而诱导这些肿瘤的发生发展[20]。因此，AML到MDS可能是疾病量化而导致的疾病进展，而MDS骨髓组织中扩增的Th17、Treg细胞通过分泌大量细胞因子一方面对新生血管增生产生促进效果，利于细胞增殖和疾病进展，另一方面对机体免疫系统活性有效抑制，增强机体对肿瘤细胞的免疫耐受性。

综上所述，AML和MDS患者外周血及骨髓组织Th17细胞、Treg细胞均升高，外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平均明显升高，其可以诱导新生血管增生，抑制机体免疫活性，促进疾病发生发展。