海参硫酸多糖化学组成与结构的研究进展

安子哲，张朝辉，刘梦阳，卢海燕，邵 影，罗娟梅，范 斌，王 莉，赵 雪

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

海参硫酸多糖包括岩藻糖基硫酸软骨素（fucosylated chondroitin sulfate，FCS）和硫酸岩藻聚糖（fucoidan，FUC），主要来源于海参体壁[1]，是一类结构独特的海洋来源的硫酸多糖。与其他生物来源多糖的结构相比，海参硫酸多糖具有独特的L-岩藻糖（fucose，Fuc）、硫酸基和岩藻糖支链等结构特性，具有抗肿瘤[2]、抗凝血[3]、抗氧化[4]、抗血小板聚集[5]和提高免疫力[6]等多种生物学活性。海参硫酸多糖的组成结构复杂，且结构对其生物活性有很大的影响。海参硫酸多糖的结构受海参种类[3]、海参生长区域[7]、多糖制备方式不同的影响而存在很大的不同。FCS主链由β-D-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine，GalNAc）和β-D-葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）构成二糖重复单元，支链由具有不同聚合度的Fuc构成；FUC主链由α-L-Fuc构成，部分具有支链，两者均含有少量葡萄糖（gluctose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）等其他单糖[4]。不同海参硫酸多糖的结构差异在于单糖的种类和物质的量比、主链单糖的组成、硫酸基团的含量及位置、支链的位置和结构等。本文对不同海参来源硫酸多糖的化学组成和结构进行分析比较，以期为其进一步结构分析和构效关系研究提供参考依据。

1 海参FCS的化学组成与结构

1.1 海参FCS的化学组成

早在1980年，樊绘曾等[8]就从刺参（Stichopus japonicus）体壁中提取出一种酸性黏多糖，其主要含有GlcUA、GalNAc、Fuc和硫酸基，物质的量比为1.00∶0.88∶0.85∶3.68。1988年，Vieira等[1]发现巴西海参（Ludwigothurea grisea）FCS中除主要含有GlcUA、GalNAc、Fuc外，还含有少量的Gal。如表1所示，相关研究表明不同海参来源FCS的化学组成差异较大。

表1 不同海参FCS的化学组成比较Table 1 Comparison of chemical composition of FCS from different sea cucumber species

续表1

通过分析比较不同海参来源FCS的单糖组成发现，其均主要含有GlcUA、GalNAc、Fuc，但三者物质的量之比不尽相同。其中刺参（Stichopus japonicus）、绿刺参（Stichopus chloronotus）、墨西哥海参（Holothuria mexicana）、革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）、白斑海参（Holothuria polii）、大乌爪参（Holothuria tubulosa）、小乌爪参（Holothuria stellati）、小有刺参（Holothuria floridana）和Eupentacta fraudatrix9种海参中支链岩藻糖的物质的量分数较高，其GlcUA与支链岩藻糖物质的量比（GlcUA∶Fuc）均在1∶1.3以上，其中刺参（GlcUA∶Fuc为1.00∶2.36）和绿刺参（GlcUA∶Fuc为1.00∶2.22）中支链岩藻糖物质的量分数最高；仿刺参（Apostichopus japonicus）、花刺参（Stichopus variegatus）、美国肉参（Isostichopus badionotus）、糙刺参（Stichopus horrens）、挪威拟刺参（Stichopus tremulus）、梅花参（Thelenota ananas）、荡皮海参（Holothuria vagabunda）、巴西海参（Ludwigothurea grisea）、巴塔哥尼亚海参（Hemioedema spectabilis）、象鼻参（Holothuria fuscopunctata）、智利瓜参（Athyonidium chilensis）、海地瓜（Acaudina molpadioidea）和海棒槌（Paracaudina chilensis）13种海参中支链岩藻糖物质的量比适中，GlcUA∶Fuc均约为1∶1；玉足海参（Holothuria leucospilota）、黑海参（Holothuria atra）、黑乳海参（Holothuria nobilis）、红腹海参（Holothuria edulis）、白底辐肛参（Actinopyga mauritiana）、大穴居海参（Massinium magnum）、黄疣海参（Holothuria hilla）和北极海参（Cucumaria frondosa）8种海参中支链岩藻糖物质的量比较低，GlcUA∶Fuc约为1∶0.7～1∶0.9；而光参（Cucumaria japonica）和糙海参（Holothuria scabra）中支链Fu物质的量分数最低，GlcUA∶Fuc分别为1.00∶0.61和1.00∶0.53。但不同文献报道中同种海参FCS的单糖组成和硫酸基含量也不尽相同，如樊绘曾等[8]报道的刺参中GlcUA、GalNAc、Fuc、硫酸基物质的量比为1.00∶0.88∶0.85∶3.68，而Kariya等[9]报道的同种刺参中GlcUA、GalNAc、Fuc、硫酸基物质的量比为1.00∶0.85∶2.36∶4.63，该差异同样体现在对绿刺参[10,12]和巴西海参[1,21]的报道中，其原因可能是不同研究团队对多糖的提取制备、纯化及分析技术和参种的生长区域及来源存在差异。

在海参FCS中，还部分含有Gal、GlcN和Glc等其他单糖。研究者们在仿刺参（Apostichopus japonicus）、巴西海参（Ludwigothurea grisea）（Gal与GlcUA物质的量比（Gal∶GlcUA）为0.17）、小有刺参（Holothuria floridana）（Gal∶GlcUA为0.28）、黄疣海参（Holothuria hilla）（Gal∶GlcUA为0.12）、光参（Cucumaria japonica）（Gal∶GlcUA为0.14）和海棒槌（Paracaudina chilensis）（Gal∶GlcUA为0.38）6种海参中发现了少量Gal的存在；在仿刺参（Apostichopus japonicus）、小有刺参（Holothuria floridana）（GlcN与GlcUA物质的量比（GlcN∶GlcUA）为0.16）和海棒槌（Paracaudina chilensis）（GlcN∶GlcUA为0.11）3种海参中发现了少量GlcN的存在；在仿刺参（Apostichopus japonicus）、黑乳海参（Holothuria nobilis）（Glc与GlcUA物质的量比（Glc∶GlcUA）＜0.01）、红腹海参（Holothuria edulis）（Glc∶GlcUA＜0.01）和小有刺参（Holothuria floridana）（Glc∶GlcUA为0.05）4种海参中发现了微量Glc的存在。

不同海参来源FCS的硫酸基物质的量分数差别也较大（表1）。其中刺参（Stichopus japonicus）、绿刺参（Stichopus chloronotus）、糙刺参（Stichopus horrens）、大乌爪参（Holothuria tubulosa）、小乌爪参（Holothuria stellati）和Eupentacta fraudatrix6种海参中硫酸基物质的量分数较高，硫酸基与GlcUA物质的量比均大于4∶1；其次为仿刺参（Apostichopus japonicus）、花刺参（Stichopus variegatus）、美国肉参（Isostichopus badionotus）等17种海参，硫酸基与GlcUA物质的量比均在3∶1～4∶1之间；而糙海参（Holothuria scabra）、荡皮海参（Holothuria vagabunda）、革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）等9种海参硫酸基物质的量分数较低，硫酸基与GlcUA的物质的量比均小于3∶1。

1.2 海参FCS结构的多样性

1.2.1 海参FCS主链的结构特点

研究者们最初通过研究巴西海参（Ludwigothurea grisea）[1]海参FCS的化学组成发现，其单糖组成中以GlcUA、GalNAc和Fuc为主，物质的量比约为1∶1∶1。采用甲基化法分析、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和二维核磁共振（two dimensional nuclear magnetic resonance，2D-NMR）分析结果表明，巴西海参FCS的主链结构模式为[→4-β-D-GlcUA-β-1→3-D-GalNAc-1→]n，与陆地动物来源的硫酸软骨素主链结构类似，其GlcUA的C-3位上存在岩藻糖支链。Vieira等[22]于1991年使用温和酸处理水解了岩藻糖支链，之后进行酶解与NMR、2D-NMR分析，发现了4种硫酸基取代模式不同的硫酸软骨素结构单元，分别为：[→4GlcUA-β-1→3-GalNAc-β-1→]（O型）、[→4GlcUA-β-1→3-GalNAc4Sβ1→]（A型）、[→4GlcUA-β-1→3-GalNAc6Sβ1→]（C型）和[→4GlcUA-β-1,3-GalNAc4,6diSβ1→]（E型）。在此基础上，Mourão等[23]通过2D-NMR发现其岩藻糖支链上硫酸基取代模式主要为C-4单硫取代，存在少量C-2,3和C-2,4双硫取代；至此，Mourão团队最终确定了巴西海参FCS的主链结构模型（图1）。1990年，Kariya等[9]采取了酸水解岩藻糖支链、酶解、凝胶柱纯化与气相色谱-质谱联用方法分析了刺参（Stichopus japonicus）FCS主链的结构，质谱结果表明其主链中含有硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E和非硫酸化软骨素O等4种不同单元结构，与Mourão等[23]的研究结果一致。

图1 巴西海参FCS的结构模型[23]Fig. 1 Structure formula of fucosylated chondroitin sulfate from Ludwigothurea grisea[23]

结合研究者们对海参FCS主链结构的分析，其主链结构模式可归纳为[→4-β-D-GlcUA-1→3-β-D-GalNAc-1→]n，GalNAc的C-4、C-6或C-4,6位上存在硫酸基取代，硫酸基取代模式及含量随海参品种变化而不同。

1.2.2 海参FCS支链的结构特点

研究表明，海参FCS的支链组成以不同聚合度的硫酸化岩藻糖为主，暂未发现其他类型支链，其主要连接在GlcUA的C-3位、GalNAc的C-4或C-6位，硫酸基取代模式主要为C-4位单硫取代、C-2,4或C-3,4位双硫取代。

海参FCS的平均结构模型如图2所示。研究者们通过NMR、2D-NMR等方法研究了美国肉参（Isostichopus badionotus）[7]、挪威拟刺参（Stichopus tremulus）[7]、荡皮海参（Holothuria vagabunda）[7]、革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）[7]、糙刺参（Stichopus horrens）[10]、绿刺参（Stichopus chloronotus）[10,12]、大乌爪参（Holothuria tubulosa）[26]、小乌爪参（Holothuria stellati）[26]、巴塔哥尼亚海参（Hemioedema spectabilis）[27]、Eupentacta fraudatrix[28]、大穴居海参（Massinium magnum）[29]、海棒槌（Paracaudina chilensis）[30]、象鼻参（Holothuria fuscopunctata）[31]、光参（Cucumaria japonica）[33]、智利瓜参（Athyonidium chilensis）[34]、大西洋海参（Holothuria coluber）[35]和仿刺参（Apostichopus japonicus）[36]17种海参中FCS的结构，核磁结果表明上述海参中FCS的主链结构均为[4-β-D-GlcUA-1,3-β-D-GalNAc-1]n，GalNAc的C-4、C-6或C-4,6位上存在硫酸基取代，岩藻糖支链（n=1）均位于GlcUA的C-3位上（模型一），硫酸基位于Fuc的C-3、C-4、C-2,4或C-3,4位上（图2A），其硫酸基取代模式如表2所示。

图2 海参FCS的平均结构模型Fig. 2 Structural formula of FCS from sea cucumber

续表2

除主链GlcUA的C-3位连接有岩藻糖支链外，研究者们通过NMR、2D-NMR等方法在刺参（Stichopus japonicus）[37]、白底辐肛参（Actinopyga mauritiana）[25]、黄疣海参（Holothuria hilla）[30]和北极海参（Cucumaria frondosa）[32]4种海参中发现了连接在主链GalNAc C-4或C-6位上的L-岩藻糖支链（n=1），硫酸基位于主链GalNAc的C-4、C-6或C-4,6位上和岩藻糖支链的C-4、C-2,4或C-3,4位上（模型二）（图2B），其硫酸基取代模式见表2。

2018年，Agyekum等[38]采用傅里叶变换离子共振回旋串联质谱方法研究了美国肉参（Isostichopus badionotus）和革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）中FCS的结构，质谱结果表明其主链结构均为[→4-β-DGlcUA-1→3-β-D-GalNAc-1→]n，岩藻糖支链均位于GlcUA的C-3位上，硫酸基均位于主链GalNAc的C-4和C-6位，岩藻糖支链硫酸基取代模式存在差异，美国肉参FCS以C-2,4双硫取代为主，而格皮氏海参FCS以C-3,4双硫取代为主（图3）。

图3 美国肉参（A）和格皮氏海参（B）FCS的结构模型[38]Fig. 3 Structural formulae of FCS from Isostichopus badionotus (A)and Pearsonothuria graeffei (B)[38]

随着技术的不断发展，研究者们还发现了海参FCS中存在聚合度较高的岩藻糖支链（n=1～4）。2018年，Li Qinying等[39]通过NMR、2D-NMR和亲水液相色谱串联质谱技术（hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HILIC-CID-MS/MS）研究了墨西哥海参（Holothuria mexicana）FCS的结构，发现了聚合度较高岩藻糖支链（n=1～4）的存在，其主要连接在主链GlcUA的C-3位或GalNAc的C-6位，硫酸基位于主链GalNAc的C-4或C-6位和支链岩藻糖的C-2或C-4位（图4A）。2020年，Niu Qingfeng等[6]通过NMR、2D-NMR和HILICCID-MS/MS发现白斑海参（Holothuria polii）和大乌爪参（Holothuria tubulosa）FCS中同样存在聚合度较高的岩藻糖支链（n=1～3）（图4B、C），与Li Qinying等[39]研究结果不同的是，其岩藻糖支链主要位于主链GlcUA的C-3位，GalNAc的C-4或C-6位未发现岩藻糖支链。

图4 墨西哥海参（A）、白斑海参（B）、大乌爪参（C）FCS的结构模型[6,39]Fig. 4 Structural formulae of FCS from Holothuria mexicana (A),Holothuria polii (B) and Holothuria tubulosa (C)[6,39]

2 海参FUC的化学组成与结构

2.1 海参FUC的化学组成

与海参FCS的化学组成不同，海参FUC的化学组成较为简单，不同海参来源的FUC中均主要由Fuc构成，但其中仍含有少量的Man、GlcN、GlcA、GalNAc、Glc和Gal等其他单糖，不同海参品种之间硫酸基物质的量分数差异较大（表3）。

表3 不同海参FUC的化学组成比较Table 3 Comparison of chemical composition of FUC from different sea cucumber species

通过分析比较不同海参来源FUC的单糖组成发现，其均主要由硫酸化岩藻糖构成，但硫酸基与Fuc物质的量比有较大差异。其中花刺参（Stichopus variegatus）、绿刺参（Stichopus chloronotus）、糙刺参（Stichopus horrens）、梅花参（Thelenota ananas）、白斑海参（Holothuria polii）、大乌爪参（Holothuria tubulosa）和象鼻参（Holothuria fuscopunctata）7种海参FUC的硫酸基物质的量分数较高，硫酸基与Fuc物质的量比均在1∶1以上，其中白斑海参FUC中硫酸基与Fuc物质的量比最高，分别为1.40∶1.00、1.12∶1.00；刺参（Stichopus japonicus）、美国肉参（Isostichopus badionotus）、挪威拟刺参（Stichopus tremulus）、黑海参（Holothuria atra）、荡皮海参（Holothuria vagabunda）、革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）、巴西海参（Ludwigothurea grisea）、图纹白尼参（Bohadschia marmorata）、红腹海参（Holothuria edulis）、白腹海参（Holothuria albiventer）、大西洋海参（Holothuria coluber）、小有刺参（Holothuria floridana）、北极海参（Cucumaria frondosa）和海地瓜（Acaudina molpadioidea）14种海参FUC的硫酸基物质的量分数适中，硫酸基与Fuc的物质的量比在0.6∶1.0～1.0∶1.0之间；而仿刺参（Apostichopus japonicus）、黑乳海参（Holothuria nobilis）和黄玉参（Stichopus naso）的硫酸基物质的量分数较低，硫酸基与Fuc的物质的量比约为0.5∶1.0。

在海参FUC中，部分含有Man、Gal、GlcN、GlcUA、GalN和Glc等其他单糖。研究者们在仿刺参（Apostichopus japonicus）（Gal与Fuc物质的量比（Gal∶Fuc）为0.07）、荡皮海参（Holothuria vagabunda）（Gal∶Fuc为0.10）、小有刺参（Holothuria floridana）（Gal∶Fuc为0.13）和北极海参（Cucumaria frondosa）（Gal∶Fuc为0.22）4种海参中发现了少量Gal的存在；在刺参（Stichopus japonicus）、仿刺参（Apostichopus japonicus）（GlcUA与Fuc物质的量比（GlcUA∶Fuc）为0.11）、花刺参（Stichopus variegatus）和小有刺参（Holothuria floridana）（GlcUA∶Fuc为0.02）4种海参中发现了少量GlcUA的存在；在仿刺参（Apostichopus japonicus）、小有刺参（Holothuria floridana）和北极海参（Cucumaria frondosa）3种海参中发现了少量GalN和GlcN的存在；在仿刺参（Apostichopus japonicus）（Man与Fuc物质的量比（Man∶Fuc）为0.165）和小有刺参（Holothuria floridana）（Man∶Fuc为0.01）中发现了微量Man的存在。

2.2 海参FUC结构的多样性

2.2.1 海参FUC主链的结构特点

与海参FCS不同，海参FUC的主链结构较为简单。研究表明，不同海参FUC的主链均主要由α-1,3连接的硫酸化岩藻糖构成主链，其他单糖含量较少，硫酸基位于岩藻糖的C-2、C-4或C-2,4位。

2020年，Li Qiang等[44]通过NMR和2D-NMR方法研究了绿刺参（Stichopus chloronotus）FUC的结构，核磁结果表明该多糖主要由α-1,3连接的硫酸化岩藻糖构成主链，未发现支链，硫酸基位于L-Fuc的C-2位，与Shang Feineng等[46]对糙刺参（Stichopus horrens）FUC的结构研究结果一致（图5A）。He Wentao等[57]通过甲基化分析、NMR和2D-NMR方法研究了白肛海地瓜（Acaudina leucoprocta）FUC的结构，甲基化分析和核磁结果表明该多糖主要由α-1,3连接的硫酸化岩藻糖构成主链，未发现支链，硫酸基位于Fuc的C-2、C-4或C-2,4位（图5B）。研究者们通过NMR、2D-NMR和电喷雾诱导碰撞解离串联质谱等方法对美国肉参（Isostichopus badionotus）[45]、梅花参（Thelenota ananas）[48]、白斑海参（Holothuria polii）[53]、大乌爪参（Holothuria tubulosa）[54]、革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）[58]和海地瓜（Acaudina molpadioidea）[59]6种海参FUC的结构进行了研究，均提出了α-1,3连接的四糖结构单元模型，硫酸基位于Fuc的C-2或C-2,4位（图5C）。2018年，Cai Ying等[55]通过NMR和2D-NMR方法研究了白腹海参（Holothuria albiventer）FUC的结构，核磁结果表明其由α-1,3连接的六糖结构单元构成主链，未发现支链，硫酸基位于Fuc的C-2或C-2,4位（图5D）。

图5 具有α-1,3糖苷键的不同海参FUC结构模型[44-45,48,53-59]Fig. 5 Structural formulae of FUC with α-1,3 linkage from different sea cucumber species[44-45,48,53-59]

2018年，Shang Feineng等[46]通过NMR和2D-NMR方法发现了梅花参（Thelenota ananas）和象鼻参（Holothuria fuscopunctata）FUC中存在α-1,4连接的结构，其均由α-1,4连接的三糖结构单元构成主链，未发现支链，硫酸基位于Fuc的C-2或C-3位（图6A）。2020年，Gao Na等[31]通过NMR和2D-NMR方法研究了象鼻参（Holothuria fuscopunctata）FUC的结构，发现了其含有2种不同结构单元的FUC，其中而组分I由α-1,3与α-1,4交替连接的四糖结构单元构成主链，硫酸基位于Fuc的C-2或C-2,4位，而组分II由α-1,4连接的三糖结构单元构成主链，硫酸基位于Fuc的C-3位，均未发现支链（图6B）。

图6 具有α-1,4糖苷键的海参FUC结构模型[31,46]Fig. 6 Structural formulae of FUC with α-1,4 linkage from different sea cucumber species[31,46]

2.2.2 海参FUC支链的结构特点

2004年，Kariya等[40]通过NMR和2D-NMR方法研究了刺参（Stichopus japonicus）FUC的结构，发现了其α-1,3连接的硫酸化岩藻糖主链的C-2位上存在岩藻糖支链，硫酸基位于主链和支链岩藻糖的C-2或C-4位上（图7A）。2015年，Yu Long等[42]通过NMR和2D-NMR方法研究了仿刺参（Apostichopus japonicus）FUC的结构，发现了其主链由α-1,3连接的硫酸化岩藻糖构成三糖重复单元，并且主链的C-4位上存在非硫酸化岩藻二糖支链，硫酸基位于主链岩藻糖的C-2位上（图7B）。2018年，Yang Wenjiao等[35]通过甲基化、NMR和2D-NMR方法研究了大西洋海参（Holothuria coluber）FUC的结构，发现了其主链由α-1,4连接的硫酸化岩藻糖构成四糖重复单元，并且主链的C-3位上存在岩藻糖支链，硫酸基位于主链岩藻糖的C-3位和支链岩藻糖的C-4位上（图7C）。

图7 具有支链的海参FUC结构模型[35,40,42]Fig. 7 Structural formulae of FUC with branched chains from different sea cucumber species[35,40,42]

3 结 语

随着人们对海参硫酸多糖结构的深入研究和分析技术的不断发展，其结构研究已经取得了很大进步，各技术如甲基化、液相色谱-串联质谱、NMR及2D-NMR等被研究者们广泛应用以解析不同海参硫酸多糖的精确结构，但其仍面临着巨大挑战。进一步研究海参硫酸多糖的结构有助于探究海参硫酸多糖的活性机理，进而为海参硫酸多糖的应用提供理论支持。相信随着结构分析技术手段不断进步，海参硫酸多糖的新型化学组成和结构会不断被发现，这将会极大促进其作为功能性食品或药品的开发进程。