硫化氢通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路改善代谢综合征大鼠的心肌纤维化

郑霞 谭文婷 易嘉莉 李亚灵 刘达 王森 宋熊 张晶晶 褚春 杨军

(南华大学 1附属第一医院心血管内科，湖南 衡阳 421000；2附属第二医院药剂科)

代谢综合征(MS)是指机体的碳水化合物、脂肪及蛋白质等物质发生代谢异常并集中出现的一种临床症候群，是多种心血管疾病发生与发展的重要危险因素〔1〕。MS人群的心血管疾病发生率呈逐年上升趋势〔2〕，而且其可导致负性心室重构，最终引起心力衰竭。MS可能与炎症反应、氧化应激、细胞自噬、内质网应激有关〔3，4〕，但其内在调控机制仍不是十分清楚。转化生长因子(TGF)-β1/Smad2通路不但参与了MS的发病过程，而且与心肌纤维化的发生及发展密切关联〔5〕。硫化氢(H2S)是近些年来发现的内源性气体信号分子，已被证实在体内具有广泛的生物学效应，研究显示其具有抗内质网应激、抗凋亡、抗炎、抗纤维化等多种生物学效应〔6〕。本课题组前期发现，H2S可以通过不同的机制减轻多种不同心血管疾病大鼠的心肌纤维化，而H2S是否可以减轻MS大鼠的心肌纤维化及具体作用机制目前尚不明确，因此本研究以高糖高脂饮食诱使大鼠发生心肌纤维化，同时予以H2S干预，观察H2S对MS大鼠心肌纤维化的影响及内在的调控机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 体重(150±20)g的40只健康成年雄性SD大鼠，由长沙斯莱克动物实验中心提供，在温度(24±3)℃、通风度和湿度适宜的实验室内单笼喂养，采用人工照明，设定光照周期为12 h。大鼠均自由摄食和饮水。

1.2实验主要试剂 硫氢化钠 (NaHS)购于Sigma公司；彩色预染Marker购于Fermentas公司；TGF-β1、Smad2、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔抗大鼠一抗及抗兔二抗均购自Proteintech公司。

1.3分组及模型的建立 40只雄性SD大鼠放于适宜的环境中适应性喂养7 d，然后分成：正常组、MS组、MS+H2S组、H2S组，每组10只大鼠，MS组及MS+H2S组采取高糖高脂饮食的方式造模〔7〕，其余两组喂养同等量的普通饲料。按查阅文献中的指标确定建模成功后〔8〕，MS+H2S组和H2S组予以NaHS〔56 μmol/(kg·d)，用生理盐水稀释〕腹内注射6 w，另两组则以同等量的生理盐水腹内注射，6 w后，称量所有大鼠的体重后将其麻醉处死，留取心脏标本，用于后期检验。

1.4血清生化指标及尾动脉血压检测 各组大鼠予以不同的饲料喂养6 w后，以测量3次有效的尾动脉收缩压平均值为大鼠的血压；禁食后抽取空腹血，以血糖检测仪(试纸法)测取空腹血糖；采1.5～2.0 ml的尾静脉血，三酰甘油以甘油磷酸氧化酶法测定，胆固醇以酶比色法测取。

1.5Masson染色分析纤维化程度 取甲醛固定的大鼠心肌组织，以石蜡包埋，制作厚约4 μm的切片，常规脱蜡至水，以不同浓度的乙醇进行脱水处理后，以Masson试剂盒染色，并以梯度酒精脱水，最后树胶封片，在光学显微镜下进行观察。

1.6Western印迹观察心肌组织中TGF-β1、Smad2蛋白的表达 取各组大鼠的部分心肌组织，充分研磨后提取组织蛋白，然后对照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明书有步骤的完成蛋白定量，并严格遵照Western印迹的具体步骤，常规电泳、转膜和封闭，并以TGF-β1、Smad2等兔抗大鼠一抗及抗兔二抗孵育，电化学发光(ECL)显影照相，留取条带图。最后对所得的目的条带进行分析。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行LSD-t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠体重、血糖和血脂情况比较 与正常组比较，MS组和MS+H2S组体重、血压、三酰甘油及总胆固醇水平明显上升(P<0.05)，而以上所测的指标在MS组和MS+H2S组之间则无明显差别(P>0.05)。见表1。

表1 各组体重、血压、三酰甘油、总胆固醇及TGF-β1蛋白、Smad2蛋白、胶原纤维沉积

2.2各组心肌组织Masson染色对比分析 与正常组比较，MS组的心肌细胞排列不规则，镜下可见到较多蓝染的纤维，而与MS组对比，MS+H2S组镜下可见胶原沉积情况显著改善(P<0.05)。H2S组与正常组大鼠心肌组织的胶原纤维沉积无显著差异(P>0.05)。见表1、图1。

深蓝色条状物即为被染色的胶原纤维，红染的为肌纤维图1 H2S对大鼠心肌纤维化沉积的影响(Masson染色，×400)

2.3各组心肌组织TGF-β1蛋白的表达情况 与正常组比较，MS组心肌组织中TGF-β1的表达水平显著上调(P<0.05)；与MS组相比，H2S+MS组心肌组织中TGF-β1的表达显著下调(P<0.05)。而H2S组与正常组大鼠心肌组织TGF-β1的表达对比无明显区别(P>0.05)。见表1、图2。

2.4各组心肌组织中Smad2的表达 与正常组比较，MS组心肌组织中Smad2的表达水平显著上调(P<0.05)；而与MS组对比，H2S+MS组心肌组织中Smad2蛋白的表达水平显著下调(P<0.05)。而H2S组与正常组心肌组织Smad2蛋白的表达水平对比无明显区别(P>0.05)。见表1、图2。

图2 各组心肌组织中TGF-β1、Smad2蛋白的表达水平

3 讨 论

随着久坐、高能量饮食等生活习惯的变化及肥胖人群的增多，MS目前已经变成了一种日益严峻的全球性健康问题，其主要以胰岛素抵抗、中心型/腹型肥胖、血糖及血脂异常等多种物质在体内代谢紊乱为临床表现，并可促进多种心血管疾病的发生与发展〔9，10〕。有研究发现，MS可直接导致心肌损伤和负性心室重构，增加心血管疾病发生率，最终可致使心脏舒张功能障碍，甚至是心力衰竭〔11〕。本研究通过高糖高脂饮食喂养的方式构建MS模型成功后，Masson染色显示MS组大鼠的心肌细胞排列无序，细胞间可见大量蓝染的纤维，提示MS组大鼠的心肌存在明显的纤维化。

有研究显示，氧化应激、炎症反应、自噬等参与了MS心肌纤维化的发生，但其中的具体调控机制尚不十分明确〔12，13〕。TGF-β是重要的致纤维化细胞因子，在成纤维细胞的调节、增殖、迁移及转分化中发挥了重要的作用，往往在机体各脏器发生纤维化时不可或缺。目前发现在哺乳动物中主要存在有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3这三种形式，而在TGF-β信号通路中，Smads是一种关键的传导分子，其作为最初被证实的TGF-β受体激酶底物，主要作用是将从TGF-β接收的信号直接由细胞膜传入到细胞核内。TGF-β被激活后可活化胞质内的Smads，从而进入核内并调控转录。已有诸多学者发现，TGF-β1/Smad2通路参与了多种心血管疾病的发生和发展过程〔14〕。在心肌梗死过程中，TGF-β1活化后可作用于Smad2/3，使其发生磷酸化并进入细胞核，可以诱导肌成纤维细胞(MFB)向促纤维化的MFB表型分化，最终导致心肌纤维化〔15〕。本研究提示TGF-β1/Smad2通路可能参与了MS心肌纤维化发生和发展的调控机制。

H2S是一种在一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后出现的内源性气体信号分子，已有相关报道表示，在一定浓度下对心、脑、肾等机体重要器官具有一定的保护作用，而其发挥心脏保护作用的机制主要涉及促进自噬、抑制氧化应激、抑制炎症、改善代谢等〔16，17〕。已发现H2S可以下调P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及TGF-β1改善糖尿病小鼠的心肌纤维化〔18〕。本研究结果提示，当使用外源性H2S后，MS大鼠的心肌纤维化得到了非常明显的改善，而TGF-β1/Smad2相关蛋白的表达水平也显著下调，表明H2S干预后可减轻MS大鼠的心肌纤维化，其可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。综上所述，内源性H2S可能通过TGF-β1/Smad2通路参与了MS心肌纤维化发生的调控机制，而外源性H2S供体药物可能在改善MS心肌纤维化具有重要的应用前景，而其内在调控机制仍有待进一步研究。