振腹法对寒凝证类痛经大鼠子宫体表投影温度及前列腺素E2、前列腺素F2α 的影响

耿 楠 胡 慧 谢丹丹 赵思雨 吴 凡 沈 潜

1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.北京联合大学特殊教育学院，北京 100075

原发性痛经是指女性在月经前、间、后期，特别是月经期间出现的以少腹胀痛或腰骶部酸痛为主要症状的疾病，病情严重者可导致昏厥、呕吐等症状[1-4]。现代医学手段治疗原发性痛经通常通过服用镇痛药物缓解疼痛感，但停药后症状易反复，远期效果不佳且具有一定副作用[5-7]。原发性痛经中以寒凝血瘀证为常见证型，其主要症状是以经期或经前小腹冷痛为主，遇温则痛减，经量少偶有血块为主要临床表现。振腹推拿法治疗寒凝证痛经临床效果确切，尤以月经前几日进行为宜[8-9]，但其起效机制尚未阐明，因此探究振腹法温经止痛的内在机制具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用鼠龄6 周龄体重（230±20）g 的雌性SPF 级SD 大鼠，由北京维通利华生物技术有限公司提供，该公司实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物质量合格证号：110011201107497612，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2019-0013。实验动物在北京中医药大学东方医院实验动物中心饲养、实验，饲养室及实验室温度保持在（20±1）℃，湿度在50%左右，自由饮用自来水，普通动物维持饲料。本实验程序均符合动物实验伦理原则，并经北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会批准进行。

1.2 主要仪器与试剂

P640 型红外热成像仪（美国FLIR 公司）；BC/BD-379HB 卧式冰柜（海尔集团）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；H2050R-1 型高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；振法推拿模拟仪（专利号：ZL201620025264.7）。

苯甲酸雌二醇注射液（批号：120207，宁波市三生药业有限公司）；缩宫素注射液（批号：120302，上海禾丰制药厂）；戊巴比妥钠[批号：T20080530，金木水火土科技（北京）有限公司]。

1.3 实验分组

通过阴道涂片法[10]筛选出30 只处于动情期且生长处于6 周龄的SD 雌性大鼠，将其按照随机数字表法分为对照组、模型组和振腹组，每组10 只。

1.4 模型制备

模型组和振腹组大鼠采用冰柜冷冻后在大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，在观察行为学前，在大鼠腹腔注射缩宫素联合致痛进行模型制备[11-12]。①致敏：在大鼠腹部皮下连续10 d 注射苯甲酸雌二醇用以对缩宫素产生敏感性，第1 天及第10 天每只注射量为0.5 mg/d，第2～9 天每只注射量为0.2 mg/d。②致痛：第10 天注射苯甲酸雌二醇后1 h 内，在大鼠腹腔注射缩宫素注射液2 U/只，两者联合致痛。③冷冻：第1～10 天大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇后将大鼠放入-25℃冰柜冷冻4 h，每2 小时打开冰柜5 s。对照组连续10 d 给予注射同等剂量的生理盐水。

1.5 模型评价标准

①寒凝证：根据寒证表证评分[11]判断大鼠畏寒蜷缩、毛发黯淡、大便稀薄及脉络瘀血4 个主要症状的寒凝程度（表1）；模型组子宫体表投影温度应低于对照组。②痛经：模型组扭体潜伏期应低于对照组，扭体次数应增多，大鼠每分钟扭体评分应升高（扭体反应能够最直接表达大鼠痛经，是应用最广泛地评价内脏痛的行为学指标），以上提示模型制备成功。

表1 寒证表证评分情况

1.6 干预方法

模型制备成功后，于致敏第11 天开始进行振腹干预。振腹组每日以推拿振法模拟仪定量模拟振腹法，取穴以关元穴为中心，按摩头为半径2 cm 的球形结构，设定频率为500 次/min，振幅为3 mm，干预时长15 min。振腹组、模型组连续10 d 给予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，即第11 天和第20 天每只注射较多剂量为0.5 mg/d，第12～19 天每只大鼠皮下注射0.2 mg/d。每日1 次，共注射10 次。对照组同样连续10 d 给予注射同等剂量的生理盐水。

1.7 指标检测

1.7.1 扭体反应 本实验采用Schmauss 等[13]提出的行为学评分标准，分为4 个等级。其中0 级为行为正常大鼠：正常姿势（手爪平放盒底或正常探査行为）；若大鼠腹部疼痛导致身体斜向一边则定为1 级；若大鼠腹部疼痛导致后肢伸展，后爪背屈，躯体伸展伴频繁地盆骨侧向旋转则定为2 级；若大鼠腹部疼痛导致其后肢后伸则定位3 级。扭体反应的潜伏期、扭体次数和扭体评分皆记录为20 min 内。其中大鼠注射缩宫素（致痛）后至出现扭体反应的时间（min）为大鼠扭体潜伏期。扭体评分=[0 级（次数）×0 分+1 级（次数）×1 分+2 级（次数）×2 分+3 级（次数）×3 分]。

1.7.2 子宫体表投影温度 振腹治疗阶段，致痛20 min后，以1%戊巴比妥钠0.4 ml/100 g 麻醉大鼠，子宫体表投影区剃毛备皮，将大鼠固定在透明鼠板上，鼠腹与摄像头的距离固定为3 cm，在室温（23±1）℃，湿度（60±5）%的条件下，检测子宫体表投影区温度。

1.7.3 酶联免疫吸附试验检测血清前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的含量 各组大鼠检测子宫体表投影区温度后，即刻取血2 ml 置于促凝试管内，然后应用离心半径8.4 cm 的离心机进行低温离心（转速3500 r/min，15 min），取血清，-20℃保存备用。PGF2α、PGE2含量采用酶联免疫吸附试验试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）检测，按试剂盒说明书进行操作。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠扭体反应结果比较

模型组扭体潜伏期短于对照组，扭体次数多于对照组，扭体总评分高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），提示模型制备成功。振腹组扭体潜伏期长于模型组，扭体总评分低于模型组，扭体次数少于模型组，差异具有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表2。

表2 三组大鼠扭体反应结果比较（）

表2 三组大鼠扭体反应结果比较（）

注 与对照组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

2.2 三组大鼠子宫体表投影温度、血清PGF2α、PGE2 水平比较

模型组子宫体表投影温度、PGE2水平均低于对照组，PGF2α水平高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；振腹组子宫体表投影温度、PGE2水平均高于模型组，PGF2α水平低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表3。

表3 三组大鼠子宫体表投影温度、血清PGF2α、PGE2 水平比较（）

表3 三组大鼠子宫体表投影温度、血清PGF2α、PGE2 水平比较（）

注 与对照组比较，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。PGF2α：前列腺素F2α；PGE2：前列腺素E2

3 讨论

在中医学中原发性痛经又被称为经行腹痛，病位在胞宫，有寒热虚实之分，寒凝血瘀型原发性痛经的患者多因经期前后感受寒邪，使寒邪客于胞宫，气血瘀阻，冲任不畅，“不通则痛”[14]，以“寒”与“瘀”为其基本致病因素[15]。因此本实验采用将雌性大鼠置于冰柜中冷冻致全身寒凝，并于大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇加强对致痛物质缩宫素的敏感性，然后腹腔注射缩宫素致痛，最终造成寒凝证类痛经大鼠模型。致痛后模型组较对照组扭体潜伏期缩短，扭体评分增高，提示模型制备成功。红外热成像技术主要是通过观察机体体表的温度变化来研究机体生理病理现象[16]，符合中医认识疾病的规律，即“欲知其内者，当以观乎外”。本实验制备寒凝证类痛经大鼠模型冷冻温度-25℃，时间4 h，连续10 d，致痛后，模型组子宫体表投影温度降低，间接反映子宫局部缺血缺氧状态。

现代医学认为原发性痛经的病理机制与PG 关系密切，比如PGE2、PGF2a[17-18]，其中PGE2可抑制子宫平滑肌的自发活动，PGF2α可调控子宫平滑肌收缩[19]，PGF2α表达水平增高，痛经症状严重[20]，非妊娠子宫PGF2α则促进子宫平滑肌收缩加重，一旦子宫内膜中PGF2α含量过多，会导致子宫平滑肌异常痉挛性收缩，子宫内膜血流减少，组织缺血缺氧，诱导酸性代谢产物产生，堆积于肌层，引发痛经[21]。在雌二醇及缩宫素致痛经模型大鼠中，子宫组织及血液中PGF2α含量显著增加，电针大鼠合谷穴可以显著降低痛经模型大鼠血液及子宫组织中PGF2α的含量进而缓解痛经症状[22]。振腹法以调气温经为特色，善于温经通络缓急止痛，这恰好与寒凝证痛经相互契合[23]，直达腹部三焦胞宫，有效达到“通则不痛”的目的[24]。振腹法是脏腑推拿的重要支系，具有调整阴阳、培补元气、温阳散寒、调理冲任、温煦胞宫的功效[25]。关元穴位于脐下3 寸，为任脉腧穴。关，关卡也；元，元气，意指任脉气血中的寒湿水饮在此关卡不得上行。现代研究将辣根过氧化物酶注入大鼠关元穴区，通过神经束路追踪技术研究关元一级感觉神经元在脊神经节的阶段分布，结果显示，关元穴和子宫组织的传入投影在腰3 至骶5 之间的脊神经节内汇聚重叠，这可能是子宫与关元穴联系的神经基础[26]。本实验应用振法模拟仪模拟振法，置于以关元穴为中心的大鼠腹部，振腹干预中按摩头上可触及神阙穴，神阙穴与五脏相同，可调理冲任元阳、通达气血、行气止痛[15]，下至中极穴，该穴为任脉、足三阴经之会，具有补气调经功效，侧至调经止痛、理气和血的子宫穴（经外奇穴），将振腹仪调至高频率低幅度振动状态进行操作[27]，达到固本培元、温经散寒、缓急止痛的作用。

本实验研究显示：振腹推拿治疗寒凝证类痛经大鼠不仅可以减少痛经模型大鼠的扭体次数（P ＜0.05）、降低扭体评分（P ＜0.01），还可以延长扭体反应的潜伏期（P ＜0.01），提示振腹推拿手法可以缓解缩宫素诱导的痛经大鼠子宫肌的剧烈收缩，抑制子宫平滑肌痉挛而起到“解痉止痛”的作用。同时振腹干预可以增高痛经大鼠子宫体表投影温度（P ＜0.01），调控血清PG，即降低类痛经大鼠血清中PGF2α的含量，升高PGE2含量，提示振腹法抑制子宫平滑肌痉挛收缩，改善局部组织缺血缺氧进而达到“温经止痛”的作用。