胃癌组织中脂肪酶H 的表达情况及临床意义

喻大军 李志祥 王 凯

蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，安徽蚌埠 233000

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的发病率和死亡率均在世界癌症排名榜前列[1-2]，其中约43%的患者在中国，2015 年有480 000 例新患者和340 000 例死亡患者[3]。在晚期阶段，胃癌只能对症治疗而不能完全治愈。因此，探索早期具有诊断价值的肿瘤标志物对于胃癌患者至关重要，可以给予个体化的治疗，提高患者生存率[4]。脂肪酶H（lipase member H，LIPH）是一种编码膜结合蛋白酶的基因，既往关于LIPH 的研究主要集中于突变及其与少毛症的关系[5-7]。近期，关于LIPH 的研究主要是其在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和胰腺癌中的意义[8-11]。本研究通过分析LIPH在胃癌组织中的表达情况和临床病理学特征关系，探索LIPH 与胃癌预后关系。

1 材料与方法

1.1 材料

正常胃黏膜细胞GES-1 和胃癌细胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-45 均购自中科院细胞研究所。同时选取2014 年1 月至2015 年12 月于蚌埠医学院第一附属医院（以下简称“我院”）行外科手术的95 例胃癌患者，收集其癌组织和癌旁组织的蜡块标本。所有患者均诊断明确为胃恶性肿瘤，并且在进行胃癌根治术前均未接受任何形式的治疗。研究前全部患者均签署知情同意书，同意参与相关研究。研究方案由我院伦理委员会进行审核和批准。

1.2 主要试剂

鼠抗人抗体LIPH（ab192615）、β-actin（ab6276）购自英国艾博抗公司，二抗鼠抗（S0002）抗体购自美国Affinity 生物公司。RPMI-1640 培养基（11875119）、胰蛋白酶（25200072）购自美国Gibco 公司，胎牛血清（11011-8611）购自浙江天杭生物科技股份有限公司。蛋白印迹试剂盒（P0012A）及BCA 蛋白浓度测量试剂盒（P0012S）购自上海碧云天生物技术公司。

1.3 细胞及细胞培养

正常胃黏膜细胞GES-1 和胃癌细胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-45 细胞均使用RPMI1640 培养基进行培养。培养基按10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素配置，细胞均培养于37℃、5%CO2饱和度湿度条件下的培养箱中。当细胞生长至培养皿70%时，使用0.25%胰酶进行传代操作，2～3 d 传代1 次。

1.4 Western blot 法检测LIPH 蛋白表达水平

使用RIPA 裂解液将细胞在冰上裂解30 min。在4℃、14 000 g 状态下离心10 min，收集上清液。随后使用BCA 法测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE 凝胶分离蛋白质，并通过转膜将蛋白转印到PVDF 膜上。将PVDF 膜封闭在含有5%脱脂牛奶中2 h。封闭结束后，使用TBS 溶液洗膜3 次，5 min/次。洗膜结束后分别与LIPH（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗孵育，放入4℃冰箱中过夜。随后将PVDF 膜与鼠二抗（1∶1000）室温孵育2 h 并放于摇床中充分结合。最后使用ECL 显影液对条带进行显影，利用暗室曝光显影。

1.5 免疫组化检测LIPH 蛋白

对95 例患者的癌组织和癌旁组织的蜡块标本进行切片、脱蜡等处理。然后通过SP 法进行免疫反应，滴加一抗LIPH（1∶200），4℃冰箱孵育过夜。加二抗（1∶500），室温孵育1 h。DAB 化学染色，苏木精复染。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。通过根据切片染色面积和棕黄色颗粒判断免疫组化结果。结合统计学分析，研究LIPH 与临床病理特征。免疫组化结果判读：细胞浆可见棕黄色颗粒。将每张切片随机选取5 个高倍视野（400×），按阳性着色强度和阳性细胞百分比进行评分，阳性着色强度：0 分（阴性），1 分（弱阳性，浅黄色），2 分（中等阳性，棕黄色），3 分（强阳性，褐色）。阳性细胞百分比：0 分（0%～＜1%），1 分（1%～＜25%），2 分（25%～＜50%），3 分（50%～＜75%），4 分（75%～＜100%）。免疫染色总分=阳性着色强度×阳性细胞百分比评分。总分范围0～12 分，0～4 分为阴性，5～12 分为阳性[12-13]。免疫组化读片结果均由两名以上高级别病理医师共同完成。

1.6 分组方法及随访

将95 例患者按LIPH 表达情况分为阳性组和阴性组，对两组进行为期60 个月的随访。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；计数资料采用百分率表示，比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，log-rank 检验进行生存曲线比较。采用Cox 比例风险回归模型进行影响因素分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常胃黏膜细胞与胃癌细胞株中LIPH 表达情况比较

胃癌细胞株MGC-803、AGS、MKN-45、BGC-823、SGC-7901 的LIPH 表达高于正常胃黏膜细胞GES-1，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

2.2 胃癌患者癌组织及癌旁组织中LIPH 表达情况

免疫组化结果显示，胃癌组织中LIPH 阳性表达呈棕色或者棕褐色，见图2。癌组织中LIPH 阳性率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 胃癌患者癌组织及癌旁组织中LIPH 表达情况[例（%）]

2.3 LIPH 阳性组和阴性组预后情况

随访60 个月，95 例患者中死亡人数74 例，累积生存率为22.1%。Kaplan-Meier 分析结果显示，阳性组累积生存率低于阴性组，差异有统计学意义（logrank χ2=25.513，P ＜0.001）。见图3。

2.4 胃癌患者预后的影响因素分析

单因素分析结果显示，LIPH 表达、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM 分期、分化程度均与胃癌预后相关（P ＜0.05）。多因素分析结果显示，LIPH 表达阴性、浸润深度T1～T2、无淋巴结转移、TNM 分期Ⅰ期均为胃癌患者预后保护因素（HR ＜1，P ＜0.05）。见表2。

表2 胃癌患者预后的影响因素分析

3 讨论

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[14]。近些年来，胃癌患者的治疗方法仍然以手术为主[15]。但是大部分患者在病程中仍然发生了远处转移。因此迫切需要发现一种生物标志物和治疗靶点。LIPH 促进肠道吸收的脂肪酸或用作能源或能源储备[16]。LIPH 被证明促进乳腺癌细胞增殖[17]、转移[18]。LIPH 在肺腺癌及非小细胞肺癌患者中表达上升[19-20]。但也有研究显示，在食管腺癌中LIPH 的高表达与患者生存时间的延长呈正相关，具有评价预后的价值[21]。本研究结果显示，LIPH 在胃癌组织中的表达阳性率高于癌旁组织。多因素分析结果显示LIPH 表达阴性、浸润深度T1～T2、无淋巴结转移、TNM 分期Ⅰ期均为胃癌患者预后保护因素，提示LIPH 可能是一种肿瘤预后的标志物。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路在调控癌症细胞的多种生物学行为中起到重要作用[22-25]。因此，后期将选择该通路进行预实验，探索LIPH 调控胃癌增殖的作用机制。

综上，LIPH 在胃癌组织中高表达，并与胃癌预后相关。检测LIPH 表达情况为胃癌患者的治疗提供新的可能。