猪细小、猪伪狂犬和猪繁殖与呼吸综合征病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

刘斌赵翠青刘立明沙万里董文龙李国江

（1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 132109；2.吉林省预防兽医学重点实验室，吉林 132109）

病原的检测方法多种多样，传统的检测方法如PCR技术、分离鉴定、胶体金等，存在特异性、灵敏性较差，操作复杂，时间、试验成本较高等缺点。而本研究选用的TaqMan多重荧光定量PCR方法是近年来新兴的快速检测方法，具有操作简单、准确灵敏、高效、稳定等优点[1]。本研究应用TaqMan多重荧光定量PCR技术构建了PPV、PRV和PRRSV三重荧光定量PCR检测方法，以期为猪免疫抑制性病原快速检测提供有效的方法。

猪细小、猪伪狂犬和猪繁殖与呼吸综合征病毒，这三种常见的免疫抑制性病毒，均可直接或间接引起猪群的免疫抑制性疾病且具有较为相似的临床症状，此外三种病毒因其季节性、感染年龄等都较为相似，混合感染的病例较为常见。发生疾病时无法通过临床症状和病理变化做出准确的诊断，传统检测方法也只能对单一病原做出准确判断，在生产实践中尤其当出现多种病原混合感染时，在疾病早期极易产生错误的判断，对养殖场产生巨大的损失。本文旨在建立一种能够在单管内同时对多种病原进行且精确高效的检测方法，从而对此类疾病的诊断和防治产生重要意义。

1 材料

1.1 病毒与主要试剂

PPV、PRV和PRRSV病料均由吉林农业科技学院猪生态养殖及疫病防控中心保存。病毒提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR预混酶、RT-qPCR预混酶均购自TaKaRa（大连）公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自AXYGEN公司。

1.2 主要仪器

生物安全柜、超净工作台、梯度PCR仪、微量可调移液器、核酸蛋白测定仪，均购自Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪，购自BIO-RAD公司。

1.3 引物的设计与合成

从GenBank上下载PPV（登录号AY502114.1）、PRV（登录号MK622324.1）和PRRSV（登录号NC_001961.1）的全基因组序列，针对各病毒的保守区域，PPV（NS1）、PRV（gB）、PRRSV（ORF6）, 分别设计用于构建PPV、PRV和PRRSV重组质粒的PCR引物（表1）和用于荧光定量PCR的探针（表2）。

表1 常规PCR引物

表2 荧光定量PCR探针

2 方法

2.1 标准质粒的构建

自病料中提取PPV、PRV和PRRSV的基因组，以其为模板进行PCR扩增，确定为目的片段后，将其回收纯化，连入pMD18-T载体，转化感受态细胞。对构建的重组质粒pMD18-T-PPV、pMD18-TPRV和pMD18-T-PRRSV进行PCR验证，验证成功的质粒送由生物公司测序。测序结果与相对应GenBank上的序列进行比对，测定质粒浓度，按公式转换为拷贝数。

2.2 三重荧光定量PCR反应体系的优化

对PPV、PRV和PRRSV三重荧光定量PCR体系进行退火温度、引物浓度、探针浓度的优化。退火温度分别设置为55.0、55.6、56.5、57.5、58.5、59.5、60.5、61.5、62.4、63.0℃；将引物和探针浓度分别设置为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM。以确定三种病毒单重荧光定量PCR最佳反应条件。

2.3 三重荧光定量PCR特异性试验

三重荧光定量PCR体系，分别加入PCV-2（猪圆环-2型病毒）、CSFV（猪瘟病毒）、SIV（猪流感病毒）、PEDV（猪流行性腹泻）、TGEV（猪传染性胃肠炎）和JEV（猪乙型脑炎）病毒基因组作为反应模板，PPV、PRV和PRRSV标准质粒作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照进行检测，检验其特异性。

2.4 三重荧光定量PCR重复性试验

以PPV、PRV和PRRSV浓度梯度1×103、1×105、1×107copies/µL的标准质粒为模板，按照所构建的三重荧光定量PCR体系，分别进行组内、组间重复试验。使用SPSS软件分析、评价单重荧光定量PCR体系的重复性。

2.5 三重荧光定量PCR灵敏性试验

将PPV、PRV和PRRSV重组质粒标准品1.0×101～10×107copies/µL七个浓度分别作为反应模板，进行三重荧光定量PCR反应。能够扩增出曲线的标准质粒最低拷贝数，即为三重荧光定量PCR体系的灵敏度。

2.6 三重荧光定量PCR标准曲线的建立

分别取PPV、PRV和PRRSV重组质粒标准品1.0×103～1.0×107copies/µL 五个浓度梯度进行三重荧光定量PCR反应。软件上设置对应重组质粒标准品拷贝数，PCR反应结束后，制作标准曲线。

2.7 临床样品检测

利用构建的三重荧光定量PCR检测方法和普通PCR检测方法对由吉林农业科技学院猪生态养殖及疫病防控中心保存的164份病料分别进行检测，对两种方法进行比较。

3 结果与分析

3.1 标准质粒的构建

以PPV、PRV和PRRSV构建的重组质粒为模板，在特异性引物下进行普通PCR扩增，经凝胶电泳分析：PPV、PRV和PRRSV对扩增产物分别为354bp、550bp、452bp与目的片段大小一致（见图1）。重组质粒测序后，经BLAST比对分析后，三种病毒的重组质粒分别与PPV、PRV和PRRSV的序列同源性均大于98%。

图1 重组质粒鉴定

3.2 三重荧光定量PCR的反应体系优化

经过对三重荧光定量PCR的反应体系进行优化，确定的最佳反应体系如下：引物浓度分别为PPV 0.3µM、PRV 0.3µM、PRRSV 0.4µM；探针浓度分别为PPV 0.3µM、PRV 0.3µM、PRRSV 0.3µM；反应条件分别为95℃、30s，95℃、5s，59.5℃、30s，40个循环。

3.3 三重荧光定量PCR特异性

应用三重荧光定量PCR体系对PPV、PRV和PRRSV进行特异性检测，PPV、PRV和PRRSV只能扩增相应的目的基因，而其他的非目的基因及ddH2O均不能扩增（见图2）。表明所构建的单重荧光定量PCR体系特异性良好。

图2 特异性扩增曲线

3.4 三重荧光定量PCR重复性

PPV、PRV和PRRSV分别在三个浓度梯度（1×107、1×105、1×103copies/µL），进行三重荧光定量PCR重复性检测，三种猪病毒的3个浓度梯度在两种重复试验中的CV均小于5%（见表3），表明所构建的三重荧光定量PCR体系重复性良好。

表3 荧光定量PCR重复性试验

3.5 三重荧光定量PCR灵敏性

当利用PPV、PRV和PRRSV三种病毒的重组质粒标准品（1×107～1×101copies/µL）为模板进行三重荧光定量PCR检测时，7个浓度梯度均有扩增曲线，1×100 copies/µL时没有曲线（见图3），表明PPV、PRV和PRRSV三种病毒三重荧光定量PCR体系检测的灵敏度可达10 copies/µL

图3 敏感性扩增曲线

3.6 三重荧光定量PCR标准曲线制作

以PPV、PRV和PRRSV5个浓度的重组质粒标准品（1×107～1×103copeis/µL），应用优化后的三重荧光定量PCR体系，进行PCR反应。三种病毒的标准曲线R2均大于0.99（见图4）。结果表明所构建的单重荧光定量PCR体系在重组质粒标准品稀释度范围内呈现良好的线性关系。

图4 标准曲线

3.7 临床样品检测

以本试验建立的PPV、PRV和PRRSV三重荧光定量PCR检测方法与普通PCR检测方法对收集的164份临床样品进行同步检测。结果显示，三重荧光定量PCR中PPV阳性检出率为16.7%，PRV阳性检出率为10%，PRRSV阳性检出率为18.9%；其中PPV、PRV混合感染阳性检出率为1%，PPV、PRRSV混合感染阳性检出率为2%，PRV、PRRSV混合感染阳性检出率为0%；PPV、PRV和PRRSV三者混合感染阳性检出率0%。普通PCR检测中PPV阳性检出率为6.5%，PRV阳性检出率为3.6%，PRRSV阳性检出率为7.5%；其中PPV、PRV混合感染阳性检出率为1%，PPV、PRRSV混合感染阳性检出率为1%；PRV、PRRSV混合感染阳性检出率为0%；PPV、PRV和PRRSV三者混合感染阳性检出率0%。

4 讨 论

本研究选择的多重荧光定量PCR反应过程全程可视，操作方便，耗时短、准确性高[2]。而传统的普通PCR，操作复杂、耗时较长，不但需要PCR反应还需要进行电泳、紫外凝胶成像系统才能获得最终结果。且普通PCR扩增实验进程做到可视化，在特异性、灵敏性等各方面表现都要远低于荧光定量PCR[3-5]。

本研究通过BLAST三种病毒全基因序列，选取了三种病毒的保守区PPV（NS1）、PRV（gB）、PRRSV（ORF6），分别设计出特异性引物和探针。引物和探针直接关乎着PCR体系的特异性和灵敏性。本研究首先建立了单重荧光定量PCR体系，并对TM值，引物、探针浓度进行优化，确定出单重荧光定量PCR体系的最佳反应条件，在单重体系的基础上建立三重荧光定量PCR体系，最终确定的三重荧光定量PCR体系最佳反应条件：TM值59.5℃，引物和探针的最佳浓度分别为PPV 0.3Μm/0.3µM、PRV 0.3Μm/0.3µM、PRRSV 0.4Μm/0.3µM。

本研究建立的三重荧光定量PCR体系在特异性、敏感性、重复性等各个方面相较普通PCR都有着更为优秀的表现。本研究所构建的三重荧光定量PCR检测体系，能够在单管内同时对三种病原进行检测，不但使操作更为便捷，而且还减少了实验时间。利用本研究建立的三重荧光定量PCR和普通PCR对吉林地区的164份临床样品（组织器官）进行临床检测比较，结果表明，本研究建立的PPV、PRV和PRRSV三重荧光定量PCR检测方法比普通PCR方法更敏感、更特异。针对目前免疫抑制性病毒易发生多病原混合、继发感染的特点，本研究建立的三重检测体系，可以为生产实践中PPV、PRV和PRRSV的病原快速检测提供帮助，并为猪免疫抑制性疾病流行病学调查、病原检测和开发快速诊断试剂盒奠定了基础。