鞋类皮革部件中苯二胺类物质的 HPLC-MS/MS测定方法

王宁，章宦胜，苗洁，陈海园

（温州市质量技术检测科学研究院，浙江 温州 325007）

引言

对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺是广泛应用于皮革、毛皮生产领域的染色剂和染料中间体[1-2]，但也是国际公认的致癌物质。其中对苯二胺和间苯二胺均被列入世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）公布的 3 类致癌物质清单中，邻苯二胺早在1998 年即被列入美国加州 65 号提案的致癌化学品清单中。另外，苯二胺类物质经皮肤或呼吸道进入人体后，还具有免疫毒性、脏器毒性、致突变性 等危害[3-5]。我国作为鞋类生产和出口大国，在近年来的国际贸易壁垒、国内鞋产业的转型升级以及国民 对于健康安全需求提升的多重作用下，我国对于鞋产品中有毒有害物质也日趋重视[6]。2012 年等同采用ISO/TR 16178：2010 制 定 发 布 的 GB/T 29292-2012《鞋类 鞋类和鞋类部件中存在的限量物质》[7]中将对苯二胺列为“怀疑对穿着者有危害的物质”，皮革是其可能存在的主要部件种类。邻苯二胺和间苯二胺虽然没有列入其中，但在化妆品行业已被认定为禁用物质[8]，在今后皮革及鞋类行业发展中也应给予更多的重视。在检测方法方面，苯二胺类的检测方法研究主要集中在化妆品、空气、水源等方面[4-5,9-11]，而在鞋类、皮革领域研究较为少见，且研究主要针对对苯二胺的气相色谱 - 质谱联用法[12-13]，至今鞋类、皮革领域还没有发布相应的检测方法标准。本文建立了一种高效液相色谱 - 串联质谱检测方法，对鞋类皮革部件中对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺开展含量测定。

1 实验部分

1.1 仪器设备

高效液相色谱 - 串联质谱仪 （1290 Infinity II/G6495A 型），美国 Agilent 公司；超声波清洗器（SB-800DT 型），宁波新芝生物科技有限公司；数显振荡摇床（HS 501 型），德国 IKA 公司；电子天平（精度 0.0001 g），瑞士 Mettler Toledo 公司；电子天平（精度 0.001 g），德国 Sartorius 公司。

1.2 标准物质和试剂

对苯二胺标准物质（p-PDA，CAS：106-50-3，纯度 99.7%）、 邻 苯 二 胺 标 准 物 质（o-PDA，CAS：95-54-5， 纯 度 99.9%）、 间 苯 二 胺 标 准 物 质（m-PDA，CAS：108-45-2，纯度 99.9%），北京曼哈格生物科技有限公司生产；甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯均为色谱纯，由上海安谱实验科技股份有限公司提供。

1.3 标准溶液的配制

分别称取 10.0 mg 对苯二胺、邻苯二胺、间苯二胺标准物质于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制 成 质 量 浓 度 分 别 为 997、999、999 mg/L 的单一标准储备液，4 ℃避光保存。分别移取 1003、1001、1001 μL 的苯二胺、邻苯二胺、间苯二胺单一标准储备液于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成各标准物质浓度均为 100 mg/L 的混合 标准中间液，4 ℃避光保存。临用时，用混合标准中间液逐级稀释，甲 醇 定 容 ，配 制 成 5、10、20、50、100、200、500 μg/L 的系列混合标准工作液。

1.4 样品前处理

准确称取 0.5 g（精确至 0.001 g）剪碎的鞋用皮革样品（任意一边长度不大于 3 mm）置于 20 mL 棕色顶空瓶中，加入 10 mL 甲醇后加盖密封，待试样完全浸湿后在超声波清洗器中超声提取 60 min，将提取液滗至 30 mL 棕色顶空瓶中密闭保存，将试样再次加入 10 mL 甲醇超声提取 60 min，合并两次提取液，混匀后取适量经 0.22 μm 有机滤膜过滤，用高效液相色谱 - 串联质谱仪进行分析测定。

1.5 液相色谱和质谱条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱为 ZORBAX Extend C18 （3.0 mm×100 mm，3.5 μm），柱温为 30 ℃，流动相为甲醇和水，体积比为 10∶90，流速为 0.3 mL/min，进样量为 1 μL。

1.5.2 质谱条件

电喷雾电离 （ESI+） 模式下，干燥气温度 280℃，干燥气流速 14 L/min，雾化器压力 35 psi，鞘气温度 300 ℃，鞘气流速 6 L/min，毛细管电压 4000 V，监测模式为多反应监测（MRM），三种苯二胺的多反应监测参数见表 1。

表1 三种苯二胺的多反应监测参数Tab. 1 MRM parameters of 3 kinds of phenylenediamines

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

选择 ZORBAX Extend C18 （3.0 mm×100 mm,3.5 μm）为分析用色谱柱，分别考察了甲醇 / 水、乙腈 / 水、甲醇 /5 mmol/L 乙酸铵水溶液、乙腈 /5 mmol/L 乙酸铵水溶液流动相体系对三种待测组分的分离效果。在 0.3 mL/min 流速下，甲醇 / 水体系获得的分离度和响应性最好，在水相中加入 5 mmol/L乙酸铵可以有效改善对苯二胺的峰型，但间苯二胺和邻苯二胺的响应值较甲醇 / 水体系存在显著的降低。乙腈 / 水和乙腈 /5 mmol/L 乙酸铵水溶液体系虽然也能获得良好的分离度，但三种待测组分的响应值均较低。因此最终选定甲醇 / 水为流动相，且经比例 调 整 比 较 后 确 定 甲 醇 / 水 的 流 动 相 体 积 比 为10∶90。

2.2 提取方式的选择

目前实验室常见的提取方法主要有超声提 取 、振荡提取、索式提取等。索式提取操作较为繁琐、提取时间较长，并且本研究的三种待测组分在高温下易被氧化，因此不考虑使用。本研究取鞋用 皮革阳性样品，分别在常温下进行甲醇超声提取和振荡提取 ，处 理 时 间 均 为 60 min，所 得 提 取 效 果 如 图 1 所示。结果表明，超声提取与振荡提取相比，三种苯二胺的提取量均较高，因此选用超声提取作为本试验的提取方式。

图1 三种苯二胺在不同提取方式下的提取效果Fig. 1 The extracting effects of 3 kinds of phenylenediamines with different extracting method

2.3 提取溶剂的选择

分别用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作为 溶剂对皮革阳性样品进行超声提取，所得结果见图 2。由图可见 ，甲醇 对 三 种 苯 二 胺 的 提 取 效 果 最 佳 ，乙 腈 次之，丙酮和乙酸乙酯提取效果相近且均较差。因 此确定选用甲醇作为本试验的提取溶剂。

2.4 提取时间与次数的选择

为了考察超声提取时间对提取效果的影响，以阳性样品加入甲醇后提取 20、30、40、50、60、70、80、90 min，对提取液中三种苯二胺的含量进行测定，所得结果见图 3。从图中可以看出，随着提取时间的延长，三种苯二胺的提取量均表现出逐渐增大的趋势，在 50 min 后增长缓慢，在 60 min 时基本趋于稳定，表明在该时间点提取浓度已基本达到平衡，因此确定萃取时间为 60 min。

图3 不同提取时间对三种苯二胺提取效果的影响Fig. 3 The influence of extracting duration on the extracting effects of 3 kinds of phenylenediamines

为 确 保 皮 革 样 品 中 的 目 标 物 被 完 全 提 取 出来，对样品进行三次重复提取试验，一次、两次、三次提取所得三种苯二胺的含量见图 4。从图中可以看出，经过第二次提取，三种苯二胺的提取量均有所提升，以间苯二胺为例，第二次提取比第一次提取所得结果提升 27%。第三次提取所得结果与第二次相比没有明显差别，表明第二次提取已将样品中的目标物提取完全，因此确定试验的提取次数为两次。

图4 不同提取次数所得的三种苯二胺质量分数Fig. 4 The contents of 3 kinds of phenylenediamines obtained with different extraction frequencies

2.5 方法的线性和检出限

按照 1.3 配 制一 系 列 标 准 工 作 溶 液 ， 进 行HPLC-MS/MS 测定，以浓度为横坐标、响应值为纵坐标绘制标准工作曲线，所得三种苯二胺的线性回归方程和关系数 R2如表 2 所示。结果表明，三种苯二胺在 5～500 μg/L 质量浓度范围内线性关系良好，R2均大于 0.997。

表2 三种苯二胺的线性范围、回归方程、相关系数和检出限Tab. 2 The linearity ranges, regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 kinds of phenylenediamines

按照 1.4～1.5 的步骤，采用空白样品加标的试验方法，通过所得谱图信噪比为 3 所对应的加标水平来确定三种目标物的检出限。经过试验，对苯二胺在本试验方法条件下的检出限为 0.03 mg/kg，间苯二胺和邻苯二胺的检出限为 0.02 mg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

以 0.2、2、20 mg/kg 三个添加水平对鞋用皮革样品进行加标回收试验，每个添加水平进行 6 次独立重复试验，所得平均回收率和精密度列于表 3，其中精密度以相对标准偏差（RSD）表示。由表可知，在本试验方法条件下，三种苯二胺在 3 个添加水平下的平均回收率为 89.3%～105.7%，RSD 为 3.6%～8.1%。证明该法准确性高，精密度良好。

表3 方法的精密度和回收率Tab. 3 Precision and recovery of the method

3 结论

建立了测定鞋类皮革部件中对苯二胺、邻苯二胺、间苯二胺残留量的 HPLC-MS/MS 方法，对提取方式、提取溶剂、提取时间和次数、HPLC-MS/MS 仪器参数等条件进行研究确立。三种苯二胺在 5～500 μg/L 质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于 0.997，检出限为 0.02～0.03 mg/kg，回收率在 89%～106%范围内，相对标准偏差在 3%～9%之间，该法操作简单，检测灵敏度高、准确度和精密度良好，可用于鞋类皮革部件中对苯二胺、邻苯二胺、间苯二胺残留量的检测分析。