耐铬厌氧胶原蛋白水解菌的筛选及应用研究

丁绍兰，刘云，李重遥

（陕西科技大学环境科学与工程学院，陕西 西安 710021）

引言

中国 的制革产业每年要产生超过 100万吨铬革屑[1]，虽然胶原蛋白的含量非常高，但其中含有重金属铬，而被列为危险固体废物。目前常用的填埋、焚烧以及化学处理方法，处理过程复杂 、反应条件苛刻、还容易造成大量的胶原蛋白可用资源的浪费以及氧化成六价铬的二次污染。所以生物法处理铬革屑的研究应运而生，现有的研究主要是通过酶法和耐铬微生物水解铬革屑。

因此，本论文从制革厂含铬污泥中筛选、分离、培养、纯化得到耐铬优势厌氧菌，然后将其用于消解铬革屑脱铬后的含铬胶原蛋白液，探讨消解效果和产气性能，开发生物法消解含铬胶原废弃物的新技术。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 含铬污泥及铬革屑的来源

含铬污泥取自福建晋江秋夏皮革有限公司初沉池，置于冰箱备用。铬革屑取自福建晋江秋夏皮革有限公司。

1.1.2 储备液的配置

三价铬储备液的配置：称取 25.52 g 的碱式硫酸铬[Cr(OH)SO4]，溶于水，用浓度为 1 mol/L 的 H2SO4调节 pH 约为 1，转移至 1000 mL 容量瓶，定容，得4000 mg/L 的三价铬的储备液，4 ℃保存，稀释一定倍数后使用。

1.1.3 含铬胶原蛋白液的制备

称取 100 g 铬革屑溶于 2000 mL 水中，加入 20 g 氧化钙，于 90 ℃、200 r/min 条件下搅拌 3 h 后用浓度为 1 mol/L 的 H2SO4调节 pH 约为 7，加入 20 g中性蛋白酶（天津市福晨化学试剂厂），于 40 ℃、200 r/min 下搅拌 2 h 后用高速冷冻离心机离心 15 min (8000 r/min)，得上清液，测得其含氮量为 3066 mg/L，铬含量为 65.58 mg/L，蛋白质含量为 20.39 g/L。4 ℃保存，备用。

1.1.4 培养基的制备

（1）富集培养基

明 胶 1.0% ， 葡 萄 糖 0.5% ，NaCL 0.5% ，pH 7.2～7.5 。

（2）细菌培养基

5.0 g 牛肉膏，10.0 g 蛋白胨，5.0 g 氯化钠，20.0 g 琼脂。加热搅拌，定容至 1 L，NaOH 或 HCl 调 pH，分装，121 ℃，蒸压 20 min。

（3）真菌培养基

真菌固体培养基：称取成品孟加拉红培养基 36.7 g（内含 5.0 g 蛋白胨，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4，10.0 g葡 萄 糖，0.1 g 氯 霉素 ，0.033 g 孟 加拉 红 ，20.0 g 琼脂），煮沸溶解，加水至 1 L，121 ℃蒸压 20 min。

真菌液体培养基：除不加琼脂外（灭菌前滤纸过滤），配置成分与步骤均与固体培养基一致。

注：培养基中的碱式硫酸铬单独灭菌，使用时按比例加入培养基混匀。

1.1.5 孢子悬浮液的制备

钩取真菌，接种至平板，培养 3 d 后，接种环轻刮孢子，置于含有无菌水的锥形瓶（内含 30 颗玻璃珠），摇晃，并稀释至 OD600=0.1。

1.2 耐铬微生物的分离纯化与筛选

称取 2 g 含铬污泥，用 20 mL 生理盐水浸泡并摇匀后，取 1 mL 加入到装有 50 mL 的富集培养基的三角瓶中，35 ℃、180 r /min 恒温振荡培养 1～2 d。

吸取 1 mL 的富集培养液，移至含有 9 mL 的无菌蒸馏水的试管中，即得 10-1混合液，逐梯度稀释，得到 10-1～10-5的混合液，各梯度做 3 组平行。吸取浓度为 10-1～10-5的混合液各 100 μL，滴入到相应编号的平板，用三角刮刀（已灭菌）在平板上均匀涂布，最后用 PARAFILM 沿平板边缘进行封口。平板先正置24 h，后倒置于 35 ℃的恒温培养箱中培养 5～7 d，设置对照组。观察不同菌落生长情况，编号记录。

用接种环挑选单菌落，培养皿半揭划线，每个菌落设置 3 个平行，并设置对照组，倒置培养 3 d。多次分离纯化。

用接种环刮取固体培养基中的单菌落的纯种菌接种至添加三价铬质量浓度为 50 mg/L 的平板中，置于恒温鼓风培养箱中，设定温度为 35 ℃，倒置培养（设置三组平行）。培养 5 d 后，挑选出生长较好的菌株接种至三价铬质量浓度为 100 mg/L 的平板中，按此方法，依次将菌株分别接种到三价铬质量浓度为 100、200、400、600、800 mg/L 的培养基中，观察不同菌株在含不同浓度的三价铬的培养基中的生长情况，挑选出耐铬能力最强的菌株。

1.3 菌种的生物学鉴定

将菌株培养 3 d 后的平板，封口，寄至上海生工生物工程股份有限公司。由上海生工生物工程股份有限公司完成测序结果，并将本实验菌株的 ITS 序列结果在 NCBI（美国国立生物技术信息中心）上进行 BLAST 分析，挑选 15 株同源序列，用 MEGA 6.0软 件 中的 ClustalxW 软 件进 行 序 列对 比 ， 并 采 用Bootstrap 方法重复计算 1000 次进行自检分析，采用“邻接法”构建系统发育树（phylogenetic tree），得出鉴定结果。

1.4 耐铬菌厌氧消解含铬胶原蛋白液

采用恒温水浴摇床控制厌氧发酵瓶内的温度为 35 ℃，往发酵瓶内通入氮气吹扫 3 min 连接排水集气装置。在厌氧发酵瓶中加入含铬胶原蛋白液、蒸馏水、耐铬菌孢子悬浮液、葡萄糖，控制耐铬菌不同的接种量不同的碳氮比，用 1∶1 的稀硫酸和30%的 NaOH 溶液调节反应体系的 pH 约为 7.0。然后将厌氧发酵瓶放入到恒温水浴摇床，设定温度 35℃，转速 110 r/min，进行厌氧消化实验，每隔 24 h 记录产气量，直到几乎没有排出来的液体，判断消化反应达到终点，停止实验。用 0.2 L 集气袋采集适量反应产生的气体，注入气相色谱仪检测气体组分，根据标准气体曲线计算气体各组分含量。每三天对消化液进行取样，测定 pH、铬浓度和蛋白质 浓 度 。计算累积产气量并考察反应过程中体 系 的 pH、铬含量、蛋白质含量变化。

2 结果与讨论

2.1 耐铬厌氧微生物的筛选

经过富集与梯度稀释培养后 ， 在 真 菌培养基（不含铬）和细菌培养基（不含铬）中进行了 4 次分离与纯化，从含铬污泥中总共得到细菌 3 株、真菌 1株 、 放 线 菌 1 株 ， 细 菌 分 别 命 名 为 BN1、BN2 和BN3，真菌命名为 FN，放线菌命名为 AN。

在平板筛选的过程中，观察到平板中三价铬的浓度越高，毒性越大，对细菌的正常生长代谢影响较大，与细菌相比，放线菌与真菌对三价铬的耐受性更好。在进一步实验过程中，毒性较大的培养基中 FN受到的影响较小。而 AN 的生长几乎完全受到抑制，说明放线菌的生长受到三价铬的抑制。相比较而言，真菌对三价铬的耐受性明显优于其他菌。经筛选最终得到 1 株优势真菌 FN，进行后续实验。

2.2 菌种的形态观察与分子生物学鉴定结果

真 菌 FN 鉴 定 所 用 引 物 序 列 ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， 所用引物序列 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，扩增序列为 ITS1与 ITS4 内转录间隔区 1 和 2，DNA 经 PCR 扩增后，菌株 FN 的 ITS 产物片段大小为 569 bp。将本实验菌株 FN 的 ITS 序列结果在 NCBI （美国国立生物技术信息中心）上进行 BLAST 分析，挑选 15 株同源序列，用 MEGA 6.0 软件中的 ClustalxW 软件进行序列对比，并采用 Bootstrap 方法重复计算 1000 次进行自检分析，采用“邻接法”构建系统发育树，如图 1 所示。

基于 ITS 的系统进化树如图 1 所示，菌株 FN与 2 株黄曲霉菌 (Aspergillus flavus strain USMG09与 Aspergillus flavus strain Af01) 和 2 株米曲霉菌(Aspergillus oryzae strain sscl-3 和 Aspergillus oryzae isolate MH2)的可靠值高达到 99%，与其他菌株 Aspergillus pseudotamarii、Aspergillus caelatus等的差异性较大。由于黄曲霉和米曲霉的基因组非常接近，所以只根据系统发育树单一的鉴定法较难判断。只能推断菌株 FN 为黄曲霉或米曲霉。根据白飞荣等[2-3]对黄曲霉与米曲霉辨别的研究，结合菌株FN 的 3 种显微 镜 下的形态观察与平板中 生 长情况，真菌 FN 的孢子在平板培养 3～4 d 时，孢子呈黄绿色，在第 5～8 d 培养时，孢子颜色逐渐变为深褐色，与齐祖同[4]中所描述的米曲霉的特征一致，所以确定本实验分离的菌株 FN 为米曲霉。

图1 菌株 FN 与相近菌株基于 ITS 序列系统进化树Fig. 1 phylogenetic tree of strain FN and similar strains based on its sequence

2.3 耐铬菌厌氧消化含铬胶原蛋白液

2.3.1 碳氮比对厌氧消化的影响

对 碳 氮 比 为 20 ∶1 （A1）、25 ∶1 （A2）、30 ∶1（A3） 的耐铬菌与含铬胶原蛋白液的厌氧消化进行了探究，同时与不投加碳源组（A4）的厌氧消化进行对比。实验结果见图 6。

由图 2 可知，随着碳氮比逐渐升高 （从 20 至30），反应系统 pH 逐渐降低，碳氮比为 30 时降至4.30～4.50。这是由于提高碳氮比会导致消化液中的有机氮浓度减少，而在厌氧消化中是由有机氮脱氮后产生的氨氮来控制消化液不过度酸化，以维持pH 的稳定[5]。有机氮浓度的减少会使消化液中的氨氮浓度也随之降低，系统 pH 无法再保持中性开始下降，但是在反应后期消化液中仍有碱度让 pH 不再继续下降。当碳氮比为 30 时，pH 过低已经不适宜于厌氧微生物的生长，产气过程受到抑制。

图2 不同碳氮比下厌氧消化的 pH 变化Fig. 2 pH change of anaerobic digestion under different C/N ratios

由图 3 可知，A1、A2、A3 的日产气量均在第二天达到峰值，在 3～4 d 产气量急剧下降，这表明 A1、A2、A3 有明显的生物代谢，原因可能是反应开始时消化蛋白液中含有溶解氧，有机物消解速率快，从第二天开始，溶解氧消耗完后开始厌氧消化，由于有机物的分解使铬胶原蛋白液中有机酸的浓度升高，消化液呈酸化状态，所以导致产气量急剧下降的情况。这三组的日产气量基本呈平稳趋势，且产气量低。原因可能是 pH 过低，不利于微生物的生长，导致整个厌氧发酵缓慢。A4 在第 8 天日产气量出现峰值后趋于平稳，且产气量低。原因是含铬胶原蛋白液中本身的碳源不足以维持厌氧微生物的正常生长代谢，导致厌氧微生物生长受到抑制，厌氧发酵过程启动缓慢，随着碳源的不断消耗，产气过程在 20 d 之后停止。

图3 不同碳氮比下厌氧消化的日产气量Fig. 3 Daily gas production of anaerobic digestion under different C/N ratios

由图 4 可知，A2 日累积产气量最多且增速最快，产气能力最强，所以控制碳氮比为 25 时最适宜耐铬厌氧微生物对含铬胶原蛋白液的消化作用。这一实验结果与许多文献中提到的厌氧消化的最适碳氮比为 25 一致[6-7]，与单一底物的厌氧消化相比，添加额外碳源并在碳氮比为 25 时进行厌氧共消化，反应系统运行状况最好，产气量最高，而且可以在一定程度上保留消化液的养分，同时实现沼气 和沼液资源的利用。

图4 不同碳氮比下厌氧消化的日累积产气量Fig. 4 Daily cumulative gas production of anaerobic digestion under different C/N ratios

研究表明，添加碳源后耐铬菌对含铬胶原蛋白液中的铬具有一定的去除作用，耐铬菌通过代谢途径或物理 - 化学吸附途径去除胶原蛋白液中的三价铬。由图 5（a）可知 A1、A2、A3 在 9 d 后去除率基本不再变化，原因是长期接触三价铬，导致生长代谢减弱，这与 Ksheminska[8]等的研究结果一致，三价铬对真菌 Pichia guilliermondii 的生长有抑 制 作 用 ，同时微生物表面官能团的吸附位点有限，限制了微生物对重金属三价铬的进一步去除。继续增加接种时间，去除率不再升高。机制研究表明，三价铬大部分通过主动吸收进入原生质体，少数集中在细胞壁。很多学者对真菌去除水溶液中的三价铬也进行了研究，Sepehr 等[9]在不同培养条件下，研究了 2 株活曲菌(黑曲霉 Aspergillus niger、米曲霉 Aspergillus oryzae)对三价铬去除效果的影响。结果表明：在最优的培养条件下，真菌的初始接种量为 0.8 g/L（以干菌丝质量计算），黑曲霉和米曲霉的最大吸附量分别为 185 mg/g 和 208 mg/g，在实际含三价铬废水中的脱铬率分别为 72 %和 67 %。在本研究中耐铬菌的作用对象为革屑经碱酶法 预处理后的含铬胶原蛋白液，其中大部分三价铬与胶原纤维中的羧基通过配位的方式结合，所以导致对铬的去除率在胶原蛋白液中不如在含游离铬的废水中。

图5 不同碳氮比下厌氧消化对铬的去除率和对蛋白的水解率Fig. 5 Removal rate of chromium and hydrolysis rate of protein by anaerobic digestion under different carbon nitrogen ratio

除不额外添加碳源的 A4 组外，A1、A2、A3 对铬的去除率几乎不存在差别，这说明只要能保证足够的碳源，耐铬菌对铬的去除效率不受碳氮比的影响。

由图 5（b）可知，在厌氧消化的反应初期，微生物对蛋白质的消耗比较快，说明此时微生物代谢旺盛，分解有机物快。而在消化反应中后期，由于 pH的降低与有机物含量不断减少，厌氧微生物的活性降低，反应体系中蛋白质含量几乎不发生变化。A2蛋白质水解率最高，30 d 水解率为 65.2%，说明碳氮比为 25 时最适宜耐铬菌的生长。其次为 A1，30 天水解率为 54.9%。A3 在 3 d 水解率达到 20.59%后，体系中的蛋白质含量只在小范围内变化，这是因为碳氮比过高导致蛋白液过度酸化，过低的 pH 不再适宜厌氧微生物的生存。没有添加碳源的 A4 组对蛋白质的水解率比较低，在 12 d 达到 20.7%后由于蛋白液中本身含有的碳源被消耗完，微生物的代谢停滞，蛋白质含量不再减少。

2.3.2 接种量对厌氧消化的影响

对耐铬菌接种量分别为 10%、25%、50%时含铬胶原蛋白液的厌氧消化效果进行了探究，同时与以含铬胶原蛋白液为单一底物（B4）厌氧消化进行对比。实验结果见图 6～8。

由图 6 可知，耐铬菌对含铬胶原蛋白液进行厌氧消化极易出现酸化现象，pH 迅速降低，会对体系内厌氧消化过程产生抑制，甚至导致反应停止。随着接种量的升高，反应体系 pH 下降，原因是接种的耐铬厌氧胶原蛋白水解菌在反应初期对有机物的分解积累了大量的有机酸，使 pH 急剧下降，产气也受到抑制。发酵 7 d 之后，pH 小幅度回升使得酸化现象得到缓解，日产气量也出现了小高峰，之后 pH稳定在 5.0 左右，且产气量低。

图6 不同接种量下厌氧消化的 pH 变化Fig. 6 pH change of anaerobic digestion under different inoculation amounts

由图 7 可知，各处理组日产气量趋势基本相同，均是在厌氧发酵的第二天达到峰值，其中接种量最高的 B3 组达到峰值时日产气量最高，达到 414 mL，没有投加耐铬菌的 B4 组整体产气量最低，最高日产气量只有 56 mL。在发酵到18 d 之 后 各 组 的 日 产 气 量趋于平稳且低，厌氧消化的过程基本停滞，原因是反应体系 pH 过低抑制了厌氧消化的过程。说明接种耐铬优势 菌 可 以 有 效 地 提 高 消 化反应的产气量。在一定范围内，添加的耐铬优势菌的接种量越多，产气量越高。

图7 不同接种量下厌氧消化的日产气量Fig. 7 Daily gas production of anaerobic digestion under different inoculation amounts

由图 8（a）可知，在一定范围内，随着接种量的增加，耐铬菌对三价铬的去除几乎呈线性增加。没有投加耐铬菌的 B4 中三价铬的浓度几乎不发生变化。虽然三价铬是微生物所必须的微量元素，在营养物质充足时，耐铬菌孢子对外界不良因子抵抗的能力较强，能够通过微生物的正常新陈代谢吸附去除三价铬，增加耐铬菌孢子的用量，相当于增加了有效吸附位点和生物作用，但长期接触高浓度的三价铬，微生物生长受到限制，导致去除率难以增加。B1、B2 在 9 d 后对铬的去除率几乎不再变化，而 B1 对铬的去除率还稍有增加，最高可达到 25.15%，原因是 B1 接种量低，消化体系中营养物质消耗慢，微生物还可以在一定程度上维持代谢活动。

由图 8（b），接种量越大，蛋白质的水解率越高，B1、B2、B3 在 30 d 内 对 蛋 白 质 的 水 解 率 分 别 为48.78%，65.2%，86.49%，而不投加耐铬菌的 B4 水解率非常低。与图 6 相似，在厌氧消化前期微生物快速繁殖，蛋白质的水解趋势较为明显，在厌氧消化进行到中后期时由于 pH 的降低以及有机底物的消耗，微生物生长缓慢，对蛋白质的水解能力降低，微生物对蛋白质水解程度基本达到饱和。

图8 不同接种量下厌氧消化对铬的去除率和对蛋白质的水解率Fig. 8 Removal rate of chromium and hydrolysis rate of protein by anaerobic digestion under different inoculation amounts

3 结论

根据本论文的实验结果，可以得到以下结论：经过富集、分离、纯化、筛选得到优势耐铬菌株 FN。通过梯度实验确定优势菌在铬胶原蛋白液中的最大耐铬质量浓度为 1000 mg/L，并对耐铬菌株进行厌氧驯化。光学显微镜下观察到真菌 FN 孢子完整的多细胞形状。扫描电镜图观察到孢子呈圆颗粒状。荧光显微镜图片看到菌丝及孢子的立体结构，菌丝互相缠绕连接，初步鉴定真菌 FN 为曲霉。经 PCR 扩增后，采用“邻接法”构建的系统发育树和在平板生长情况中培养时间延长孢子颜色逐渐变为深褐色，最终鉴定得到FN 为米曲霉(Aspergillus oryzae)。

耐铬菌接种量为 25%、初始 pH 约为 7，温度 35℃ ， 震 荡 110 r/min 条 件 下 控 制 碳 氮 比 分 别 为 20、25、30。实验结果表明：碳氮比为 25 时厌氧消化体系产气性能最佳，第二天达到最高日产气 量 295 mL，30 天累计产气 1292.5 mL，甲烷含量 52.57%，蛋白液 pH 降至 5.04， 铬 去 除 率 为31.02%，蛋白质水解率为65.2%。碳氮比为 25、初始pH 约为 7，温度 35 ℃，震荡110 r/min 条件下，投加耐铬菌量分别为 10%、25%、50%。实验结果表明：投加量为 50%时厌氧消化体系产气性能最佳，第二天达到最高日产气量 414 mL，30 d 累计产气 1648 mL，甲烷含量 45.18%，蛋白液 pH 降至 4.95，铬去除率为41.96%，蛋白质水解率 86.49%。在一定范围内，提高耐铬菌投加量可以提高产气性能和消化效果。