人冠状病毒及其疫苗的研究进展

王俊丽，贾金伦综述，卢荣华审校

1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；2.河南师范大学水产学院，河南新乡 453007

冠状病毒（coronavirus，CoV）是自然界广泛存在的一类病毒家族，其宿主范围覆盖了鸟类、哺乳类和人类，其中鸟传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV）等曾多次造成全球畜牧业的重大损失。早期的人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）由于感染后临床表现较轻被人们所忽视，2002—2003年暴发的严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和2012年暴发的中东呼吸综合征（Middle-East respiratory syndrome，MERS），由于高致死率及缺乏特效药物和疫苗，引起了全球范围内的传播；新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）在短短几个月内席卷了全球200多个国家和地区，至2020年10月9日，已造成3 600多万人感染，105.6万多人死亡［1］，不仅对全球公众健康构成了严重威胁，并阻碍了社会经济全面发展。另外，在野生动物身上陆续发现了SARS和MERS相关CoV，提示未来可能还会暴发类似HCoV感染的传染病［2］。本文就HCoV的致病性及HCoV疫苗的研究进展作一综述。

1 HCoV的致病性

HCoV主要造成呼吸道感染及引起胃肠炎和神经障碍。7种已知的HCoV中，HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1在人群中普遍存在并呈全球性分布，在呼吸系统疾病的高发季（冬春季）共流行，是引起咽喉炎和普通感冒的病毒之一，在免疫功能完善的正常人群中主要引起轻微的上呼吸道症状，但对免疫功能低下的婴幼儿及老年人可能引起重症感染［3］。HCoV-229E和HCoV-OC43于20世纪60年代分离自普通感冒患者，其病毒特性及对人类的致病力基本类似，10%～30%的普通感冒与其有关，几乎100%的儿童在幼年早期感染过，主要表现为自限性上呼吸道感染，临床过程轻微，极少有后遗症，感染后的潜伏期为2～4 d［4］。HCoV-NL63于2004年从荷兰1例患毛细支气管炎的婴儿体内分离，感染人群以婴幼儿为主，感染率约2%，主要引起小儿急性下呼吸道感染，如哮喘、毛细支气管炎等，临床症状相对较轻；成人免疫缺陷患者对HCoV-NL63也较易感［5］。HCoV-HKU1由香港大学学者WOO等于2005年从1例71岁男性肺炎患者的鼻咽抽吸物中分离获得，通常引起较轻的呼吸道感染，多数为自限性，但有基础疾病的患者感染后可导致疾病进一步加重［5］。SARS-CoV和MERS-CoV是高致病性CoV，可感染人下呼吸道并引起重症呼吸综合征。至2003年8月，全球累计SARS-CoV感染病例共8 422例，涉及32个国家和地区，死亡919例，病死率近11%，病毒学及流行病学的研究结果表明，SARS-CoV可能是几种动物病毒在动物-人种间跳跃感染产生；MERS于2012暴发于沙特阿拉伯、阿联酋等中东地区，随后波及全球26个国家和地区，目前仍有散在发病，截至2020年1月，全球共报告2 519例感染病例，其中866例死亡，病死率近35%［6-7］。2019-nCoV主要通过呼吸道飞沫、气溶胶和接触传播，由其引发的COVID-19临床表现为发烧、干咳、呼吸困难，严重时可导致SARS、肾衰竭甚至死亡。基于保守型非结构蛋白序列分析结果表明，2019-nCoV属于与严重急性呼吸综合征相关的新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronaviruses，SAR-Sr-CoV），与SARS-CoV基因组序列具有79.5%相似性，并识别相同的细胞受体——血管紧张素转换酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）［8］，因此又被称为SARSCoV-2。2019-nCoV的致病力弱于SARS-CoV和MERSCoV，但传染力强，传播迅速且潜伏期长。7种已知HCoV的特征及致病性见表1。

表1 7种HCoV的主要特性Tab.1 Main characteristics of seven kinds of HCoV

2 HCoV疫苗的研发

在已发现的7种HCoV中，SARS-CoV、MERSCoV和2019-nCoV具有较强的致病性，对人类公共卫生安全构成了极大威胁，因此针对这些病毒的相应疫苗进行了研发，其中，已有2个SARS相关疫苗完成了Ⅰ期临床试验；MERS相关疫苗有1个已完成Ⅱ期临床试验，1个完成了Ⅰ期临床试验，另有几个进入了Ⅰ期临床试验阶段［9］。由于2019-nCoV与SARS-CoV和MERS-CoV有较高的同源性，基于SARS和MERS疫苗的多年研究为COVID-19疫苗的开发提供了宝贵的经验。截至2020年9月28日，WHO公布全球共有191个COVID-19疫苗研发项目，几乎涵盖了疫苗研究的所有类型，其中40个已进入临床试验，10个已进入Ⅲ期临床试验（包括4个病毒载体疫苗、3个灭活疫苗、2个mRNA疫苗和1个重组蛋白亚单位疫苗）［10］，其中有4个为我国自主研发。

2.1H C o V基因重组疫苗 在CoV的所有非结构蛋白、结构蛋白和辅助蛋白中，结构蛋白S和N的免疫原性最好［11］。SARS-CoV N蛋白DNA疫苗可引起小鼠的体液和细胞免疫反应［12］，利用In silico方法也预测出MERS-CoVN蛋白具有诱导中和抗体和T细胞反应的表位［13］。但动物保护性实验表明，抗SARSCoV N蛋白的血清不含特异性中和抗体，因此基于SARS-CoV N蛋白的疫苗不仅不能保护小鼠抵抗同种或异种病毒的攻击，还会导致肺部因嗜酸性粒细胞浸润引起的免疫病理损伤［14］。研究表明，SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白均可在小鼠等模型动物体内产生细胞免疫应答和保护性中和抗体［15-16］，且均在Ⅰ期临床试验中可检测到疫苗诱导的体液和细胞免疫反应［9，17］。因此，除全病毒灭活疫苗和减毒活疫苗外，目前在研的各种HCoV疫苗多是基于S蛋白的基因重组疫苗，其中全长S蛋白、S1亚单位及S蛋白的RBD结构域（RBD-S）均含有中和抗原表位，可刺激机体产生中和抗体和保护性免疫反应。全长S蛋白和S1亚单位含有非中和抗原表位，因此免疫机体后再遇到同型病毒可能会导致机体的免疫病理反应，如肺部嗜酸性粒细胞浸润或抗体依赖的感染增强作用（antibody-dependent enhance-ment，ADE），因此，不含非中和抗原表位的RBD-S成为许多CoV重组疫苗研究中的首选抗原［18］。利用基因测序信息和免疫信息学技术已快速鉴定了2019-nCoV的T、B细胞表位，其中一些表位在2019-nCoV和SARS-CoV之间高度保守，以这些保守的表位序列为靶标所设计的疫苗可能会对二者产生交叉保护作用［19］。

2.1.1重组蛋白亚单位疫苗 重组蛋白亚单位疫苗是采用表达系统在体外表达抗原蛋白，分离纯化后直接将抗原蛋白作为疫苗。由于成分单一，其免疫原性较弱，通常仅产生体液免疫反应，因此需要在疫苗中添加合适的佐剂。以全长S蛋白和RBD-S为抗原的SARS-CoV重组蛋白疫苗均可诱导小鼠产生高滴度中和抗体［20-21］，MERS-CoV的重组S蛋白疫苗在实验动物体内也诱导出了较高水平的中和抗体［22］。目前2019-nCoV的重组蛋白亚单位疫苗已有13个进入临床试验［10］，见表2，其中Novavax公司开发的NVX-CoV2373已进入Ⅲ期临床试验，安徽智飞龙科马生物制药有限公司和中科院微生物研究所联合开发的RBD-sc-dimer亚单位疫苗进入了Ⅱ期临床试验［10］。NVX-CoV2373是以Matrix M1为佐剂的2019-nCoV重组S糖蛋白纳米颗粒疫苗，该疫苗在啮齿类和非人灵长类体内诱导出了较高的体液和细胞免疫反应，并能阻断病毒S蛋白与人ACE2的结合；在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中，该疫苗不仅显示出较高的安全性，还诱导出了高于COVID-19患者恢复期血浆的抗体水平［23］。RBD-sc-dimer是将两条RBD-S单链以二硫键串连在一起形成的二聚体，克服了传统单体形式RBD-S疫苗免疫原性低的问题，刺激模型小鼠产生的中和抗体滴度可高于传统RBD-S疫苗10～100倍，且这种设计在SARS、MERS和COVID-19疫苗中均适用［24］。

表2 已进入临床试验的COVID-19重组蛋白亚单位疫苗Tab.2 Recombinant protein subunit vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.1.2重组载体疫苗 重组载体疫苗是利用基因工程技术将抗原基因导入减毒或无毒的活病毒或活细菌（载体），接种宿主后在体内表达目的抗原，刺激机体产生免疫反应。与重组亚单位疫苗相比，重组载体疫苗可诱导更强的细胞免疫反应。常用的病毒载体有痘病毒、疱疹病毒、腺病毒等DNA病毒及减毒的流感病毒和黄病毒等RNA病毒，非致病性乳酸菌是最有应用前景的细菌载体。HCoV S蛋白的病毒载体疫苗已得到广泛研究，其中以减毒的人副流感病毒3型相关牛病毒（bovine counterpart of human parainfluenza virus 3，BHPIV3）为载体的SARS-CoV全长S蛋白疫苗（BHPIV3/SARS-S）和以狂犬病病毒（rabis virus，RV）为载体的SARS-CoV全长S蛋白疫苗（RV/SARS-S）在实验动物中均诱导出了保护性免疫反应［25-26］。以英国牛津大学研究人员构建的复制缺陷型黑猩猩腺病毒（Chimpanzee Adenovirus-Oxford University#1，ChAdOx1）为载体的MERS-CoV全长S蛋白疫苗（ChAdOx1 MERS）在人DPP4转基因（hDPP4 Tg+）小鼠和天然传播模型单峰驼中均诱导出了有效的保护性免疫反应，Ⅰ期临床试验证明，该疫苗具有良好的安全性和可耐受性，且单剂量免疫即可引起抗MER-CoV的体液和细胞免疫反应［27-29］。

目前，已有9个2019-nCoV病毒载体疫苗进入临床试验，见表3，其中4个处于Ⅲ期［10］，分别为康希诺生物股份公司与北京生物技术研究所联合研制的Ad5-nCoV、牛津大学和阿斯利康（AstraZeneca）联合开发的ChAdOx1 2019-nCoV、俄罗斯Gamaleya研究所的Adeno-based（rAd26-S+rAd5-S）及杨森制药的Ad26COVS1。Ad5-nCoV是将2019-nCoV的S蛋白基因和纤溶酶原激活剂（plasminoen activator）基因的信号肽部分一起克隆入非复制型人Ad5（缺乏E1和E3基因）基因组构建而成，在以≥18岁健康成年人为研究对象的Ⅰ、Ⅱ期临床试验中，诱导出了较强的中和抗体反应和T细胞免疫反应，并显示出较好的安全性［30-31］；给小鼠和雪貂鼻内接种1剂Ad5-nCoV，可保护免疫动物免受野生型2019-nCoV感染，提示该疫苗不仅有较好的免疫原性，且经黏膜途径接种是可行的［32］。ChAdOx1 2019-nCoV是以ChAdOx1为载体，表达2019-nCoV的全长S蛋白，接种小鼠和猕猴后诱导平衡的TH1/TH2体液和细胞免疫反应，可保护受2019-nCoV攻击的免疫动物不发生肺炎［33］；在以18~55岁健康成年人为研究对象的早期临床试验也显示出较好的安全性，且诱导出了较强的体液和细胞免疫反应［34］。Adeno-based（rAd26-S+rAd5-S）是将rAd26-S和rAd5-S联合使用，2种疫苗均表达2019-nCoV的全长S蛋白，在Ⅰ/Ⅱ期临床试验的第一阶段证明了rAd26-S和rAd5-S分别单独接种的安全性和可耐受性，在第二阶段先以rAd26-S初免志愿者，21 d后以rAd5-S进行加强免疫，所有接种者均产生了较强的体液和细胞免疫反应［35］。

表3 已进入临床试验的COVID-19病毒载体疫苗Tab.3 Virus-vector vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.1.3重组病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗 VLPs疫苗是由病毒的1个或多个结构蛋白组成的不含病毒基因组的空心颗粒，因此不能自主复制，不具有感染性，较灭活疫苗或减毒活疫苗更安全，同时较亚单位疫苗或核酸疫苗的免疫原性强。由SARS-CoV S蛋白与流感病毒M1蛋白或小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的E、M、N蛋白组成的嵌合型VLPs，均可诱导小鼠产生针对SARS-CoV S蛋白的保护性免疫应答［36-37］。MERS-CoV结构蛋白相关的VLPs在小鼠和猕猴体内均诱导出了较强的体液和细胞免疫反应，并可保护免疫动物不受MERS-CoV的侵染［38-39］。利用Vero E6细胞同时表达2019-nCoV的4种结构蛋白（S、M、N和E），可自动组装成稳定的VLPs［40］；将2019-nCoV的3种结构蛋白（S、M和E）mRNA分别用脂质纳米粒包封后转染HEK 293A细胞，表达的目的蛋白可自动组装成VLPs，并分泌至细胞外，将这3种mRNA按一定比例混合制成联合mRNA疫苗，免疫小鼠后产生的体液免疫反应远高于单一的S蛋白mRNA疫苗［41］。2019-nCoV RBD-S与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原共表达而形成的VLPs疫苗，目前已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验［10］。

2.2核酸疫苗 核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗，DNA疫苗由携带目的抗原基因的重组质粒组成，mRNA疫苗则使用可编码目的抗原的mRNA作为疫苗。核酸疫苗可在宿主体内表达抗原蛋白，引起免疫反应。SARS-CoV S蛋白的DNA疫苗不仅可诱导小鼠产生保护性免疫应答，在Ⅰ期临床试验中也诱导出了体液和细胞免疫反应［15，17］。美国Invivo公司通过专有密码子优化技术并添加人免疫球蛋白E（IgE）信号肽序列制备的MERS-CoV S蛋白DNA疫苗（INO-4700），提高了S蛋白的分泌表达和免疫原性，在小鼠、骆驼和猕猴中均诱导出了保护性免疫反应，在肺部感染模型中能够保护猕猴不受MERS-CoV感染［16］，该疫苗也是首个进入Ⅰ期临床的MERS疫苗，其临床试验结果显示，大部分受试者能够检测到疫苗诱导的体液和细胞免疫反应，仅产生轻微的自限性不良反应［9］；在此基础上开发的表达2019-nCoV S蛋白的DNA疫苗（INO-4800）在多种动物模型中显示出良好的免疫原性［42］，该疫苗目前已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验。除INO-4800外，还有多个COVID-19 DNA疫苗和mRNA疫苗进入临床试验，见表4，其中2个mRNA疫苗进入Ⅲ期临床试验（美国国家过敏症和传染病研究所与Moderna公司合作研发的mRNA-1273和德国Bio-NTech公司与美国Pfizer公司联合研制的BNT-162b1）［10］。mRNA-1273是将编码nCoV-19融合前S蛋白的mRNA以新型脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）包裹而成，接种该疫苗的小鼠和猕猴可迅速清除由鼻腔进入上、下呼吸道的2019-nCoV；Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示，该疫苗有较好的安全性和可耐受性，产生的中和抗体类似恢复期患者的血清抗体水平，且在老年群体中也产生了较好的免疫反应［43］。BNT162b1是由核苷修饰、LNPs为载体的脂溶性纳米制剂，可编码三聚化的2019-nCoV RBD-S，在早期临床试验中证明，具有良好的安全性和可耐受性，且适用于65～85岁的老人，肌肉注射第2剂后14 d，接种者的平均中和抗体水平达到恢复期患者的1.9～4.6倍，并可诱导出显著的TH1型细胞免疫反应［44-45］。

表4 已进入临床试验的COVID-19核酸疫苗Tab.4 Nucleic acid vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.3全病毒灭活疫苗 全病毒灭活疫苗抗原属性与天然病毒一致，可刺激机体产生针对病毒的多种蛋白和抗原表位的保护性抗体，缺点是可能会引起ADE作用。SARS和MERS全病毒灭活疫苗均在实验动物中诱导出了高效价的血清中和抗体，并可保护动物抵抗同源病毒株的攻击［46-47］。Ⅰ期临床试验也证明了SARS灭活疫苗刺激人体产生体液免疫的效力［48］。最早获批附条件上市申请的3款COVID-19灭活疫苗的生产企业，分别是国药集团中国生物北京生物制品研究所有限责任公司（2020年12月31日获批上市，HB02株）［49］、北京科兴中维生物技术有限公司（2021年2月6日获批上市，CZ株）［50］及国药集团中国生物武汉生物制品研究所有限责任公司（2021年2月25日获批上市，WIV04株）［51］。3款灭活疫苗在实验动物中均显示出较强的免疫原性，可保护非人灵长类动物抵抗强致病性2019-nCoV毒株的攻击，且未出现抗体依赖的ADE现象；Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期临床试验中未发现严重不良事件，接种后产生了显著的中和抗体反应［52-58］。

2.4减毒活疫苗 减毒活疫苗可在机体内存活一定时间，诱导强烈且持久的体液和细胞免疫应答，特别是可诱导黏膜免疫反应，因此，虽然可能存在毒力回复的风险，减毒活疫苗仍是预防性疫苗的理想选择。目前，HCoV减毒活疫苗的研究主要是采用现代遗传学技术除去或失活病毒的致病基因从而获得减毒株。已使用的目标基因有结构蛋白中的E蛋白、部分非结构蛋白（non-strudare protein，NSP）和部分辅助蛋白，均处于实验室研究阶段，尚无HCoV减毒活疫苗进入临床试验。E蛋白或NSP14蛋白基因缺失的SARS-CoV致病力均显著降低，免疫动物后可诱导高滴度中和抗体和抵抗病毒攻击的免疫保护作用［59-60］。NSP16突变的SARS-CoV和MERS-CoV突变株均表现为对Ⅰ型干扰素敏感，并可对幼年小鼠提供抗野生型病毒感染的保护力［61-62］。删去辅助基因ORF3、4和5的MERS-CoV在动物体内表现为致病力下降，其诱导产生的中和抗体，可保护hDPP4Tg+小鼠抵抗野生型MERS-CoV的攻击［63］。有3个COVID-19减毒活疫苗正在进行临床前研究，均是采用密码子去优化技术对其毒力基因进行修饰，但实验结果尚未公布［10］。

3 小结

由于CoV的自然宿主在鸟类和哺乳类动物中广泛存在，不同物种间的CoV又可能存在交叉传播，使可适应新宿主和不同感染部位的新型CoV不断出现，在此过程中人类也不断面临着新型HCoV的感染风险［2］。因此，还应全面研究不同来源CoV的生物学特性、感染致病机制、对不同环境的适应性及在人和动物体内引起的免疫反应的差异，以便尽快解决目前存在的HCoV对人类的伤害和应对可能再次出现的新型HCoV对人类的威胁。