金刺梨果渣发酵蛋白饲料研究

孔令磊 汪凯莎 唐婷婷

(安顺学院农学院，贵州 安顺561000)

金刺梨(RosaSterilisS.D.shi)还被称为“无籽刺梨”，1981年全省刺梨资源调查时首次发现，时圣德先生1985年发表于贵州省植物园[1]。金刺梨具有少刺无籽、酸甜可口、口感较脆的特点。金刺梨果实中含多种氨基酸、矿物质营养元素和维生素，并且营养元素含量非常丰富。其中VC 和黄酮的含量比一般的水果都要高，因此还被誉为“VC之王”。VC的含量中高达14.83mg/g[2]。 如今，金刺梨栽培技术日益成熟[3-7]，在贵州安顺得到大面积种植及推广，对金刺梨研究也越来越多，多家研究机构，单位和个人对金刺梨的营养成分进行分析[8-10]，果实除鲜食外，还可加工成金刺梨酒、金刺梨饮料、金刺梨酥、食醋和果酱等[11-12]，金刺梨中所含单宁[13]在多种医疗保健中得到应用，由于金刺梨很高的利用和营养价值，被人们称为“新山珍”[14]。

发酵饲料，是利用各类糟渣、食品加工后留下的副产物、杂粕等原料通过微生物的分解和转化等，产生更利于畜禽采食和利用的饲料。通过发酵后提高其饲用价值，并在一定程度上丰富氨基酸、蛋白质等营养物质[15]。近几年来，发酵饲料作为一种新型无抗饲料得到广泛的研究和发展[16]。其优势原料简单易得，来源广泛，经过发酵后的饲料具有独特的香味，不仅能提高动物的采食率以及消化利用率，还能增强动物机体免疫力[17]。

本研究使用金刺梨果渣(由天赐贵宝公司提供)，经过烘干处理，并使用选定的菌种培养获取生长曲线后种对其进行发酵。测量金刺梨果渣在发酵前后的营养成分差异，以蛋白质为参照研究金刺梨果渣在发酵后是否可作为一种理想的蛋白饲料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金刺梨果渣(由天赐贵宝公司提供)、产朊假丝酵母(Candida utilis、网上购买)、酵母膏(生物试剂)、蛋白胨(生物试剂)、琼脂粉(生物试剂)、葡萄糖(分析纯)、无水乙醇(分析纯)。

1.2 仪器与设备

折光仪、紫外可见光光度计(UV-5200PC、上海元析仪器有限公司)、高压灭菌锅(LDZX-50KB、上海申安医疗器械厂)、超净工作台(CJ-2D、天津泰斯特仪器有限公司)、恒温培养箱(DHP-9050B、上海琅轩实验设备有限公司)、振荡培养箱(HZQ-F100、江苏省太仓市华美生化仪器厂制造)、烧杯、玻璃棒、玻璃漏斗、培养皿、量筒、酒精灯、移液枪、接种环。

1.3 实验方法

金刺梨果渣发酵工艺路线：金刺梨果渣→发酵前营养成分的测定(氨基酸、蛋白质、总糖、维生素C)→发酵菌种的选取、分离、纯化、鉴定→获取发酵菌种的生长曲线→金刺梨果渣固态发酵(不同的无机氮源、菌种接种量、料液比进行单因素实验)→干燥→粉碎→发酵后营养成分的测定→果渣发酵前后营养成分的对比分析。

1.3.1 金刺梨果渣蛋白质含量的测定

蛋白质的测定通过考马斯亮蓝G-250法[18]，绘制标准曲线见图1:

图1 蛋白质标准曲线

通过标准曲线查找到金刺梨果渣样品中的蛋白质的含量(平均值)，通过公式(1)计算出样品中总氨基酸的含量：

公式(1)：蛋白质的含量(mg/g)=(M×V×100) / (m×v×1000)

式中：V:样品提取液的总体积 mL；M：标准曲线上查找所得的蛋白质含量ug ；m：所称取样品的重量g；v：测定时量取的样品体积 mL。

1.3.2 金刺梨果渣总氨基酸含量的测定

氨基酸的测定使用茚三酮显色法[19]，绘制标准曲线见图2:

图2 氨基酸标准曲线

在标准曲线上查找出氨基酸的含量(平均值),通过公式(2)计算出样品中总氨基酸的含量:

公式(2)：样品中氨基酸的含量(mg/100g)=(M×V×100)/(v×m×1000)

式中：M：标准曲线上查找所得的氨基酸含量ug；V：金刺梨果渣提取液的总体积 mL； v：测定时量取的金刺梨果渣液的体积 mL； m:实际所用金刺梨果渣的重量g。

1.3.3 金刺梨果渣总糖含量的测定

利用折光仪，将果渣碾碎有果汁流出，取适量果汁于折光仪棱镜玻璃面上进行观测，明显分界线刻度，即为金刺梨果渣的总糖的浓度。

1.3.4 金刺梨果渣维生素C含量的测定

果渣维生素C含量的测定使用2，6-二氯酚靛酚滴定法[20]，通过公式(2)计算出样品中维生素C的含量：

公式(3)：维生素C的含量(mg/100g)=[(V-V1)×V2×K](V3×M)

式中：V：样品滴定时消耗滴定液的体积 mL，VM1：空白对照消耗值 mL，V2：样品提取液体积 mL，K：染料标定值 mL，V3：测量的样品液 mL，M：果渣质量g。

滴定过程中空白对照的平均值1.9 mL。染料标定的平均值9.6 mL。

1.3.5 菌种的活化培养

菌种选取经过产朊假丝酵母(Candida utilis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces Fragilis)、啤酒酵母(Sac-charomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrihum candidum Link)四种菌种进行对比，选取合适的菌种来进行刺梨果渣的发酵。

经各项指标对比后选用产朊假丝酵母：产朊假丝酵母蛋白质的含量占菌体干物质的2/3，产朊假丝酵母细胞中维生素B和RNA以及矿物质[21]含量极其丰富,而且产朊假丝酵母中酶的含量很多，这些酶类在发酵中至关重要的作用，这些酶类能将淀粉和纤维素进行水解，是将发酵物转化为易被畜禽动物体消化吸收的低分子物质的重要媒介。产朊假丝酵母的细胞壁的含量是菌体重量的五分之一，其中有22%的物质是糖蛋白、外壁的甘露寡糖、内壁的β-葡聚糖具有激发或增强畜禽动物机体免疫功能的重要物质，其中β-葡聚糖含量高达二分之一以上[22-24]。

产朊假丝酵母是生产食用、药用或饲料用单细胞蛋白的优良菌种。其中甘露糖和β-葡聚糖可以为禽类动物增强机体免疫力，是蛋白饲料优质的发酵菌种。还含有丰富的酶类，这些酶类在发酵中能将淀粉和纤维素进行水解，将发酵物转化为易被畜禽动物体消化吸收的低分子物质。

将选取好的菌种经过分离、纯化后进行鉴定。纯化后的酵母取出观察，其形态乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐或菌丝状见图3图4:

图3 纯化后的酵母 图4 纯化后的酵母

纯化后的酵母接种到250ml装有100ml液体培养基中设置温度29℃，转速160r/min培养24h后关闭转速继续培养8h。观察液体上层不产醭见图5，锥形瓶底有菌体沉淀见图6。

图5 液体培养后的酵母 图6 液体培养后的酵母

1.3.6 菌种的生长曲线

将分离纯化好的酵母取出接种，将其接种到装有100mlYPD液体培养基的锥形瓶中用橡胶塞封住瓶口后放入振荡培养箱中进行振荡培养，把温度调为29℃，转速设置为160r/min进行振荡培养，12h后取出备用。

用灭菌移液枪准确吸取培养到生长对数期的菌液10.0ml，取提前配置好的YPD液体培养基90毫升，放入250ml锥形瓶中，再将菌液放入其中，封口。放入振荡培养箱中，打开培养箱，把温度调为29℃，转速设置为160r/min进行振荡培养。

进行时间段取样，取样时间分别0、4、8、12、16、20、24、28、32、34、36、40、44h按无菌操作进行取样，将取得的菌液在波长600nm下测量吸光度。然后绘制生长曲线，该曲线是以菌液吸光度值×稀释的倍数为纵坐标，培养时间为横坐标。测量后得出产朊假丝酵母培养液吸光度值和生长曲线，吸光度值表见表1。

表1 产朊假丝酵母不同时间培养液吸光度A

生长曲线见图7：

图7 产朊假丝酵母生长曲线

由图7可知，产朊假丝酵母生长对数期在4～28h，平稳期在28～32h，且在28h时生长对数期达最大吸光值6.470。32h后产朊假丝酵母生长开始衰退。

1.3.7 尿素对发酵结果的影响

在金刺梨果渣发酵预实验过程中，金刺梨的含氮量较少，无法满足微生物生长需求，也不能利用无机氮源合成蛋白质。因此在发酵过程重要加入少量的尿素[16]。

实验称取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，添加不同尿素1.5%、2%、2.5%，以接种量10%、料液比1∶1制成固体培养基进行单因素实验，在自然pH环境下，29.5℃恒温培养箱中发酵4d。发酵后在烘箱中60℃烘干，测定发酵后的蛋白质。其发酵因素及其发酵后蛋白质和氨基酸的含量如图8所示。

图8 不同尿素对发酵结果的影响

由图8可知，当尿素的添加量为2%时，蛋白质和氨基酸的含量最高。

1.3.8 不同接种量对发酵结果的影响 实验称取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以不同接种量10%、12%、15%、17%、20%料液比1：1制成固体培养基进行单因素实验，在自然pH环境下，29.5℃恒温培养箱中发酵4d。发酵后在烘箱中60℃烘干，测定发酵后的蛋白质。其发酵因素及其发酵后蛋白质和氨基酸的含量见图9。

图9 不同接种量对发酵结果的影响

由图9可知，当接种量为15%时，蛋白质和氨基酸的含量最高。

1.3.9 不同料液比对发酵结果的影响

实验称取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以接种量10%，以不同料液比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5制成固体培养基进行单因素实验，在自然pH环境下，29.5℃恒温培养箱中发酵4d。发酵后在烘箱中60℃烘干，测定发酵后的蛋白质。其发酵因素及其发酵后蛋白质和氨基酸的含量见图10。

由图10可知，当料液比为1:2时，蛋白质和氨基酸的含量最高。

图10 不同料液比对发酵结果的影响

2 结果与分析

2.1 金刺梨果渣发酵前各营养成分

金刺梨果渣发酵前各营养成分指标和含量见表2。

表2 金刺梨果渣发酵前营养成分

2.2 金刺梨果渣发酵后各营养成分

发酵以金刺梨果渣10g，尿素2%，接种量15%,料液比1∶2配制成固体培养基，然后将其进行发酵。发酵后，对金刺梨果渣发酵物再次进行营养成分测定，结果详情见表3。

表3 发酵后金刺梨果渣营养成分含量

由表3可知，金刺梨果渣发酵物中的蛋白质含量和氨基酸含量在发酵后会增加，发酵后的总糖和维生素C的含量减少。

3 结论与讨论

3.1 结论

本试验选取产朊假丝酵母对金刺梨果渣进行发酵实验探究，将金刺梨果渣制成固态培养基进行发酵，并对金刺梨果渣发酵前后的营养成分进行测定对比。结果显示，发酵以金刺梨10 g，尿素2%，接种量15%，料液比1：2配制成固体培养基进行发酵4d。金刺梨果渣在发酵后蛋白质含量由7.62mg/g提高到17.21mg/g，提高了126%，总糖由14%下降到2.6%，维生素C由6.53 mg/g下降到1.87 mg/g下降了71%，总氨基酸4.682 mg/g提高到8.732 mg/g。提高了86.5%。金刺梨果渣发酵后蛋白质和氨基酸都得到提高，并且蛋白质和氨基酸都是蛋白饲料的重要指标。因此金刺梨通过发酵后是一种理想的蛋白饲料。

3.2 讨论

就目前来说，金刺梨加工后留下的果渣，虽然也含有较高的氨基酸，维生素和矿物营养元素，但因其果渣处理工艺滞后，动物采食性差，大多数金刺梨加工厂都选择将金刺梨果渣废弃处理。将金刺梨果渣经过产朊假丝酵母发酵制成蛋白饲料后，蛋白质和氨基酸的含量得到大幅提高，并且产朊假丝酵母发酵制成蛋白饲料中含有甘露寡糖和β-葡聚，糖能激发或增强畜禽动物机体免疫功能。因此金刺梨果渣发酵蛋白饲料在畜禽动物中应用价值很高，且有助于解决我国饲料资源短缺的问题。

但因该工艺在初始研究阶段，在动物生产性能、肠道功能、免疫能力和繁殖性能等方面的研究，也有待进一步开展，且在动物生产中的合理添加量及添加方式也需进行深入研究，以期促进金刺梨果渣在饲料产业中的广泛应用。