新疆褐牛瘦素基因在不同部位中表达水平与肉质指标的关联性

李红波，李 娜，闫向民，叶治兵，崔繁荣，张 杨

(1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆肉牛工程技术中心，乌鲁木齐 830052；3.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】肉质性状是一个复合型的经济性状，评定指标有pH值、保水性、结缔组织含量与分布、肌纤维直径以及牛大理石花纹丰富度所决定的。pH值是反映肉的生化变化的重要指标，其对肉的颜色、嫩度、保水性都有显著影响[1]；蒸煮损失越小，肉的出品率越高[2]，剪切力越小，牛肉越嫩[3]；其中大理石花纹等级是最关键的指标，不仅有利于牛肉嫩度还直接影响牛肉的品质等级[4-6]；瘦素蛋白(leptin)是由ob (肥胖基因)编码的基因参与调节机体基础代谢和胴体脂肪沉积等并起着重要作用。【前人研究进展】leptin可显著减少乌金猪和长白猪肌内和皮下脂肪细胞中的甘油三酯和游离脂肪酸含量[7]。皮下脂肪中leptin表达量与母兔肌内脂肪含量、熟肉率和pH值呈显著的相关性[8]，血清瘦素蛋白浓度与牛胴体的大理石花纹等级、背膘厚度[9]，绵羊的脂肪沉积等呈极显著相关[10]。【本研究切入点】leptin的表达水平与肉质关系密切，能作为研究肉质一个候选基因。但leptinmRNA表达量在新疆褐牛肉质方面鲜见报道。亟需研究新疆褐牛瘦素基因在不同部位中表达水平与肉质指标的关联性。【拟解决的关键问题】选取新疆褐牛为研究对象，采用荧光定量聚合酶链式反应技术，分析其与BPI、大理石花纹、剪切力、蒸煮损失、肌肉脂肪含量等肉质性状相关性，为新疆肉牛肉质育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 褐牛

选择新疆褐牛，肉样取自伊犁西天山农牧发展有限责任公司舍饲状态，活重560 kg/头，年龄2.5～3岁，根据《新疆褐牛品种标准》要求，随机选取外貌特征显著、年龄、营养条件均一致，健康的新疆褐牛成年公牛20头，禁食12 h后屠宰。采集脂肪样品(肌间脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/样品，立即投入液氮中保存，以备提取总RNA。经屠宰后，胴体在0～4℃排酸72 h，取左侧胴体12～13肋背最长肌组织，用于肉质性状检测。

1.1.2 主要仪器试剂

仪器：BIOFUGE PRIMOR低温离心机，超ZHJH C1112B净工作台，Light Cycler 2.0荧光定量PCR仪，NanoDrop®ND-2000 Spectorphotometer可见/紫外分光光度计，CFX96TM实时定量PCR仪。

试剂：Oligo(dT)15；Ribonuclease Inhibitor，M-MLV5×Reaction Buffer，SYBR®Prime Script TMⅡ荧光定量试剂盒。

1.2 方 法

1.2.1 指标测定

1.2.1.1 体重、体高

按常规方法进行体重称量，体尺测量。根据体重和体高数据计算肉用指数(Beef purpose index) BPI值即体重与体高比值。

1.2.2 等级评定

1.2.2.1 大理石花纹

依据第12～13处背最长肌横切面内，脂肪沉积量的多少进行等级评定，大理石花纹等级从4至1依次为几乎没有、少量、丰富、极丰富，每2级间没有0.5级。

1.2.2.2 胴体脂肪覆盖

于屠宰后悬挂测定牛体皮下脂肪覆盖度面积占整个胴体总面积的比率。脂肪覆盖等级从4至1依次为特级、优一级、优二级和普通级。

1.2.2.3 pH

用NWF-IQ160G便携式pH测定仪进行测定。将探头插入到肉样中，使pH计电极与肌肉中的组织液充分接触，待pH计凑数稳定后记录，每个肉样重复测定4～6次，取平均值为最终pH值测定结果。

1.2.2.4 蒸煮损失(cooling loss, CL)

取排酸后的肉样，将附着标间的胫腱、脂肪后称重，切成约2.5 cm左右厚，用塑料袋包扎好肉样，保持袋口朝上，放入80℃水浴锅中，加盖后持续加热，直至肌肉中心温度达到70℃为止，取出肉样使肌肉冷至室温，吸干表面水分，称蒸煮后重，计算蒸煮损失。

1.2.2.5 剪切力

蒸煮损失与嫩度测定同步进行，将蒸煮后吸干表面水分并称重后的肉样，用直径为1.27 cm的空心取样器沿肌纤维方向钻取肉柱(每个样品至少取3根肉柱，避开肉筋)，然后用C-LM型嫩度计测定每个肉柱的剪切力值，取其平均值作为该样品的剪切力值。

1.2.3 总 RNA 的提取及其纯度

称取150 mg的脂肪组织，研磨至于1 mL QIAzol裂解液中，并根据RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒实验步骤进行RNA提取。获得的RNA利用紫外可见分光光度计检测纯度及浓度，RNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 荧光定量聚合酶链式反应

PCR体系：水7.4 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上有引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，模板1 μL。PCR反应程序：95℃ 3 min；35个循环(95℃ 30s，57℃ 1 min，72℃ 1 min)；72℃ 5 min，反应结束后4℃保存。

在NCBI网站上搜索目的基因序列，采用Oligo 6.0在线引物设计软件设计目的基因引物。表1

1.3 数据处理

以gapdh基因作为内参基因，采用2-△△CT法测定leptin基因的相对表达量，利用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，用邓肯法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，并利用皮尔森相关系数分析相关系数和显著性。

表1 引物序列信息Table 1 The primer sequence information

2 结果与分析

2.1 不同部位脂肪组织中leptin 基因表达水平

研究表明，新疆褐牛不同部位leptin基因相对表达量由高到低依次为肌间脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪和心周脂肪。皮下和肾周脂肪中leptin的表达水平极显著低于肌间脂肪(P<0.01)，而心周脂肪中leptin的表达水平与肌间脂肪无差异(P>0.05)；在不同部位脂肪组织中leptin基因表达水平，肌间脂肪组织显著高于其他部位脂肪组织。图1

2.2 新疆褐牛背最长肌组织肉质特性

研究表明，新疆褐牛活重平均为620.15 kg，屠宰率59.33%；BPI为4.45，经过适当的育肥条件，新疆褐牛12～13肋的横断面的面积为95.23 cm2，背最长肌的剪切力3.3 kg，肉质嫩，具有较高的商品价值，背最长肌肌内脂肪含量所占比例5.17%。表2

注：**表示在P<0.01水平具有高度统计学意义

2.3 不同部位leptin基因表达水平与肉质性状相关性

研究表明，新疆褐牛皮下脂肪组织中leptin表达水平与其外脊剪切力显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.555；与蒸煮损失显著正相关(P<0.05)，相关系数分别0.479；与肌内脂肪含量显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.474，而肾周、肌间、心周脂肪组织中leptin表达水平与其肉质性状无显著相关性(P>0.05)。表3

表3 不同部位leptin基因表达水平与肉质性状相关性Table 3 Correlation between leptin gene expression levels in different parts and meat quality traits

3 讨 论

新疆褐牛的4个部位脂肪组织中leptin基因均有表达，证实了瘦素蛋白在新疆褐牛脂肪组织中内普遍存在。新疆褐牛不同部位leptin基因相对表达量由高到低依次为肌间脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪和心周脂肪。肌间脂肪中leptin的表达水平极显著高于皮下和肾周脂肪，且与心周脂肪的表达无显著差异性。Tomoya等[11]研究表明，成年日本和牛leptinmRNA表达水平由高到低依次为肾、肌间、皮下脂肪，与研究结果不完全一致。leptin基因出现空间上的表达差异主要是leptin表达依赖于不同部位脂肪细胞形态。新疆褐牛各部位脂肪单个细胞面积大小顺序：肾周、皮下、心周和肌间；日本和牛各部位脂肪大小顺序也不同：肠系膜、肾周、肌间、皮下脂肪；同时也有研究指出，脂肪组织中毛细血管网也广泛的存在，脂肪生成依赖血管的生成，首先脂肪细胞的增殖主要发生在毛细血管簇中，其次抑制血管生成显著降低脂肪组织的重量，血管生长因子能够刺激细胞的分化，脂肪细胞也会分泌血管生长因子，脂肪组织生成基于血管形态和毛细血管的密度[12]。毛细血管网络为脂肪细胞提供营养，并允许脂肪细胞积极分泌脂肪细胞因子，如瘦素[13,14]。

瘦素是动物脂肪细胞分泌的一种蛋白质激素，可以通过作用于下丘脑调节摄食，同时还可以通过促进三酰甘油分解抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)的表达，也可以通过增加能量消耗来介导乙酰辅酶A羧化酶基因(Acetyl CoA carboxylase)的表达从而抑制脂肪的合成[15]。新疆褐牛肌内脂肪含量和皮下脂肪组织中leptin基因的表达水平呈显著正相关(r=0.474，P<0.05)，皮下脂肪组织中的leptin基因对肌内脂肪有显著影响。皮下脂肪也能反映脂肪沉积的程度，肌内脂肪也是沉积于肌束膜中的，两者具有显著相关性，也是评价牛肉品质的一个重要因素。肌内脂肪能够促进肉的嫩度，同时也可影响牛肉的多汁性[16，17]。利木赞牛肉肌内脂肪含量较低约为1.4%，且具有较高的剪切力[18]。母兔的肌内脂肪含量和皮下脂肪中leptin基因的表达量呈极显著正相关[8]，这与研究结果一致。研究南方黄牛肉质嫩度调控的分子机制中发现leptin基因表达水平与肌肉的剪切力值显著相关性，与研究结果一致[19]。研究分析了皮下脂肪中leptin基因的表达水平与肌肉嫩度(剪切力)、蒸煮损失的关系，发现皮下脂肪中leptin基因的表达可能在新疆褐牛肉质(嫩度、蒸煮损失)形成过程中起着重要的调节作用。今后需要在细胞水平上利用RNA干扰、过表达以及TALEN敲除技术来进一步验证该基因的功能，寻找新疆褐牛肉质调控相关的遗传标记。

4 结 论

新疆褐牛不同部位脂肪中leptin基因均有表达，其相对表达量由高到低依次为肌间脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪和心周脂肪。在不同部位脂肪组织中leptin基因表达水平，肌间脂肪组织显著高于其他部位脂肪组织。皮下脂肪组织中leptin表达水平与其外脊剪切力(r=0.555,P<0.05)、蒸煮损失(r=0.479,P<0.05)显著正相关，与肌内脂肪含量显著正相关(r=0.474,P<0.05)；而肾周、肌间、心周脂肪组织中leptin表达水平与其肉质性状无显著相关性(P>0.05)，提示皮下脂肪中leptin基因可能参与新疆褐牛肉质形成过程，可作为研究新疆褐牛肉质的一个候选基因。