大孔树脂纯化野山杏总黄酮工艺

金科旭，戴小华，谷虹霏，束佳敏，王天琪，海婷玉

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)属蔷薇科李亚科杏属的亚乔木植物，果肉中含有大量的黄酮类化合物。黄酮类化合物具有降血脂[1]、降血糖[2]、抗氧化[3, 4]、抗菌[5]、镇痛抗炎[6-7]等药理作用。从野山杏中提取的总黄酮含量较低。【前人研究进展】野山杏醇提物中总黄酮含量仅为5.39%[9]，影响着野山杏资源的开发利用。大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构的高分子材料，具有选择性吸附功能，主要作用于天然植物中活性的分离纯化[10, 11]，具有成本低、分离效率高、操作简单、无毒性、可工业化大批量生产等优点[12]。【本研究切入点】目前对于大孔树脂纯化植物中总黄酮成分的报道很多[13, 14]，但关于大孔树脂分离纯化野山杏总黄酮的研究尚未报道。需要研究优选大孔树脂分离纯化野山杏总黄酮的最佳工艺参数。【拟解决的关键问题】采用AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17四种大孔树脂静态比吸附量及比解吸附量为指标确定纯化最佳大孔树脂，并在此基础上选出最佳纯化条件，为野山杏总黄酮开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

野山杏干燥果肉(新疆哈密伊吾县)，芦丁≥98%(上海源叶生物科技有限公司)，D-101、ADS-17、AB-8、NAK-9大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：无水乙醇(天津，)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)。

仪器：JBT/C-YCL400T/3P(D) 超声波药品处理机(济宁金百特工程机械有限公司)、RE-52B旋转蒸发器(上海亚荣化仪器厂)、T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、SHB-Ⅲ循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、SL202N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 野山杏总黄酮提取液制备

干燥后的野山杏果肉粉碎过40目筛，加入50%乙醇(料液比为1∶50)超声1 h，提取2次，抽滤，合并滤液，旋转蒸发挥干乙醇即得到总黄酮粗提物，然后用蒸馏水将总黄酮粗提物稀释成不同质量浓度的待测液。

1.2.2 标准曲线的建立及样品总黄酮含量测定

1.2.2.1 对照品储备液制备

精确量取25.00 mg芦丁标准品于深色容量瓶中，并用60%乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，混匀，即得浓度为0.25 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.2.2.2 线性关系[15, 16]

精密吸取制得的芦丁标准品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别置于25 mL棕色容量瓶中，滴加5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀室温静置6 min，滴加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，混匀室温静置6 min，加4% NaOH溶液4 mL后混匀，用60%乙醇定容至刻度并于室温下静置15 min，在510 nm波长下用紫外可见分光光度计测定吸光值A，回归方程为y=13.851x-0.016 8，r2=0.999 4，线性关系良好。

1.2.3 不同型号吸附树脂的筛选

1.2.3.1 大孔吸附树脂的预处理[17]

将4种大孔吸附树脂(AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17)用蒸馏水清洗除去杂物及破碎树脂， 95%乙醇浸泡24 h后蒸馏水冲洗至无醇味。用5% HCl溶液浸泡6 h后用蒸馏水清洗至pH值为中性，再用5% NaOH溶液浸泡6 h后用蒸馏水清洗至pH值为中性，备用。

1.2.3.2 静态吸附-解吸性能[18]

(1)准确称量处理好的树脂各10.0 g置于锥形瓶中，分别加入野山杏总黄酮粗提液40 mL，在100 r/min，37℃恒温振荡24 h，充分吸附后抽滤并收集滤液，测量滤液吸光度值，计算滤液中总黄酮质量浓度量和比吸附量。

比吸附量=(树脂吸附前总黄酮质量浓度-树脂吸附后总黄酮质量浓度)×溶液体积/树脂质量。

(2)各取2 g吸附饱和树脂于100 mL锥形瓶中，精确加入50 mL 95%乙醇，在150 r/min，25℃下恒温振荡24 h，充分解吸后抽滤收集滤液，测定解吸液中野山杏总黄酮的质量浓度及解吸率。

比解吸量= (解吸液中总黄酮质量浓度×解吸液体积)/树脂质量。

解吸率(%)=比解吸量/比吸附量×100%。

1.2.4 D-101大孔吸附树脂纯化工艺

1.2.4.1 径高比

将野山杏总黄酮粗提液以1.0 mL/min的流速通过不同径高比(1∶4，1∶6，1∶8)的大孔树脂柱，吸附完全后用蒸馏水洗脱，再用80%乙醇洗脱，以洗脱液总黄酮含量为指标分析不同径高比对纯化工艺的影响。

1.2.4.2 最大体积

将野山杏总黄酮粗提液按1.0 mL/min的流速通过大孔树脂柱，分段收集流出溶液，计算流出液总黄酮含量。以野山杏总黄酮的泄漏量为指标考察样品溶液的最大上样量。

泄露百分数(%)=流出液总黄酮含量/上样液总黄酮含量×100%。

1.2.4.3 上样流速

将200 mL上样液分别以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速上样，测量上样前后总黄酮的含量，以野山杏总黄酮吸附量为指标考察上样速度对纯化工艺的影响。

吸附量(mg)=上样液总黄酮含量-流出液总黄酮含量。

1.2.4.4 上样浓度

配置浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的野山杏总黄酮溶液上样，上样完全后用80%乙醇洗脱剂进行洗脱，收集洗脱溶液，以洗脱溶液中的总黄酮含量为指标，分析上样浓度对纯化工艺的影响。

1.2.4.5 吸附时间

以浓度为0.3 mL/min的野山杏总黄酮溶液上样后，分别静置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，然后用80%乙醇进行洗脱，收集洗脱样液，以洗脱溶液中的总黄酮含量为指标，分析吸附时间对纯化工艺的影响。

1.2.4.6 水洗脱液体积

上样完成后用蒸馏水控制流速除去保留在树脂柱中的多糖，多糖鉴定方法为Molish反应法。当Molish反应为阴性，在510 nm处无吸收时，测量蒸馏水体积。

1.2.4.7 水洗脱液流速

上样吸附后用蒸馏水以0.5、1.0、1.5 mL/min流速进行洗脱，计算水洗脱液中总黄酮泄露百分数，以泄露百分数为指标分析水洗液流速对纯化工艺的影响。

1.2.4.8 洗脱剂的浓度

以浓度为0.3 mg/mL的野山杏总黄酮溶液160 mL上样，静止2 h后用蒸馏水洗脱，依次用50%、60%、70%、80%、90%体积浓度的乙醇溶液进行洗脱后，收集洗脱液，计算解吸率。以解吸率为指标，分析洗脱剂的浓度对纯化工艺的影响

1.2.4.9 洗脱剂流速

上样吸附后，用80%乙醇溶液分别以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速洗脱。以洗脱液中总黄酮含量为指标分析洗脱流速对纯化工艺的影响。

1.2.4.10 洗脱剂体积

上样吸附后，用80%体积浓度的乙醇溶液分别以0.5 mL/min的流速洗脱，分段收集洗脱液，每5 mL为1份，以总黄酮含量为指标考察洗脱剂的用量。

1.2.4.11 精制品总黄酮的含量

按照单因素最佳的上样和洗脱条件，以最终提取物中野山杏总黄酮的含量为考察指标进行平行试验(n=3)，验证实验的可重复性。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 不同大孔吸附树脂静态比吸附量及比解吸附量

研究表明，D-101大孔吸附的比吸附量为1.364 mg/g、比解吸附量为0.197 mg/g、解吸率为14.44%。均优于其他3种树脂，故选择D-101大孔吸附树脂对野山杏总黄酮进行分离纯化。表1

表1 4种大孔树脂对野山杏总黄酮静态比吸附量及比解吸量测定Table 1 Determination of specific adsorption capacity and specific desorption capacity of four kinds of macroporous resins on total flavonoids of Armeniaca sibirica(L.)Lam

2.2 径高比对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

研究表明，当大孔树脂柱径高比为1∶6时，洗脱液中野山杏总黄酮含量最高，选择径高比为1∶6的大孔树脂柱作为纯化树脂柱。表2

表2 径高比变化Table 2 Inspection results of the ratio of height to height

2.3 不同上样体积下大孔吸附树脂纯化工艺的变化

研究表明，当样品体积大于160 mL时，流出液中总黄酮含量明显增多，此时总黄酮开始明显泄漏。野山杏提取液的最大上样量为160 mL，即6.3 BV(6.3倍柱体积)。图1

图1 泄漏曲线Fig.re1 Leakage curve

2.4 上样流速对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

研究表明，上样流速为1.0 mL/min时与0.5 mL/min时，野山杏总黄酮吸的附量无明显差别，采样速率为1.0 mL/min作为最佳上样流速。表3

表3 上样流速Table 3 Sample flow rate

2.5 上样浓度对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

研究表明，当上样液浓度达到0.3 mg/mL时，洗脱液中总黄酮含量达到最大，随后当上样液浓度继续增大时洗脱液中总黄酮含量逐渐降低，最佳上样浓度为0.3 mg/mL。表4

表4 上样浓度Table 4 Sample Concentration Inspection Results

2.6 吸附时间对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

上样后，静置吸附时间2 h时，吸附效果最佳，故选择吸附2 h为最佳吸附时间。表5

表5 吸附时间Table 5 Inspection results of adsorption time

2.7 水洗脱液体积对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

研究表明，当收集到5 BV时观察Molish反应为阴性，同时在510 nm处无吸收，此时还原糖已去除且无总黄酮成分流出。确定水洗脱液用量为5 BV。

2.8 水洗脱液流速对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

当水洗液流速为0.5 mL/min时洗脱效果最佳，但由于三组数据差别不显著，故选择1.5 mL/min为洗脱条件。表6

表6 水洗脱液流速下泄露百分数Table 6 Effect of Washing Fluid Flow Rate on Leakage Percentage

2.9 洗脱剂浓度对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

因为D101大孔吸附树脂是弱极性树脂，而低浓度的乙醇极性较大，根据相似相容原理，应选择极性较小的高浓度乙醇[19]，解吸率随乙醇体积分数的增加而平缓上升，当乙醇体积分数为80%后，总黄酮的洗脱效果差异不大。洗脱剂浓度为80%乙醇。图2

图2 不同乙醇浓度下解吸率Fig.2 Effect of different ethanol concentration on desorption rate

2.10 洗脱剂流速对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

洗脱液流速为0.5 mL/min时洗脱效果最优，故选择0.5 mL/min为最佳洗脱流速。表7

表7 洗脱流速考察结果Table 7 Flow rate of the elution flow

2.11 洗脱剂体积对大孔吸附树脂纯化工艺的影响

研究表明，当洗脱剂用量为50 mL时，即2 BV趋于洗脱终点。确定2 BV(50 mL)为最佳洗脱量。图3，图4

2.12 验证试验

研究表明，通过D-101大孔树脂的分离纯化，野山杏总黄酮含量达到52.37%。表8

图3 洗脱剂用量Fig.3 Eluent Usage Survey Results

表8 总黄酮含量Table 8 Total flavonoid content results

3 讨 论

大孔树脂具有吸附能力强且易洗脱、可循环使用且再生处理经济环保、方便制剂成型等优势，近年来大量用于天然产物中有机成分的分离纯化[15]。许志新等[16]研究发现，D101大孔树脂能将紫玉米穗轴中花青素含量由粗提物中的0.74%纯化至29.76%，提高近40倍。不同极性、不同孔径的树脂其相应的适应范围不同，因此，对于不同成分的分离纯化的性能也是有所差异[20]。崔新梅等[18]通过对比8种大孔树脂发现，AB-8型树脂对败酱草中黄酮类化合物有较好的吸附效果。王慧芳等[19]研究发现，非极性大孔树脂HP-20更适合分离纯化陈皮黄酮。野山杏是新疆广泛分布的一种特色植物，具有丰富的营养价值，总黄酮是其有效成分之一。但野山杏醇提物中总黄酮含量较低，很难用于商业化，而大孔吸附树脂技术因较为广泛地应用于总黄酮分离纯化，且效果显著、工艺简单稳定、成本较低，所以为野山杏中总黄酮成分的工业化生产提供了更多可能[21, 22]。

4 结 论

筛选出D101型大孔树脂为最适合野山杏总黄酮的富集，最佳工艺为：最大上样量为6.3BV，上样速度为1.0 mL/min，上样浓度为0.3 mg/mL，大孔吸附树脂吸附静止2 h后，用5 BV的蒸馏水以即1.5 mL/min的流速洗脱，弃去水洗脱液，再以0.5 mL/min流速，2 BV用量的80%乙醇进行洗脱，将洗脱液干燥得深棕色固形物，经 D-101型大孔树脂纯化后的野山杏总黄酮含量为52.37%。