河北鱼源气单胞菌分离株耐药性研究

于子箫　田洋　李全振　赵宝华　陈佳乐　李清扬

摘要：为研究河北省鱼源气单胞菌（Aeromonas spp.）分离株耐药性，选取13种常见抗生素，对102株淡水鱼源气单胞菌进行K-B纸片法药物敏感性实验，并使用PCR方法检测相应耐药基因。结果显示102株受试菌株对13种抗生素表现出不同的耐药率，产生耐药性的抗生素种类范围为1～7种，共获得多重耐药菌44株，不同菌株耐药表型较丰富。分离株对阿莫西林的耐药率高达92.2%;对四环素的耐药率为18.6%;对头孢拉定的耐药率为13.7%，对头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟三种抗生素均不耐药。耐药基因检出结果与耐藥表型不完全一致。

关键词：气单胞菌（Aeromonas spp.）;耐药性;多重耐药菌

细菌对于抗菌药物的耐药性是由基因介导的遗传进化事件[1]，耐药性可能是由质粒[2]、整合子[3]介导的，耐药基因也可能存在于细菌基因组中[4]。除脆弱气单胞菌（Aeromonas trota）和少数菌株外，气单胞菌对氨苄青霉素有耐药性，同时这些细菌也对其他青霉素耐药[5]，但对单环内酰胺类、第三代第四代头孢菌素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类以及碳青霉烯类抗菌药物敏感[6]。

尽管气单胞菌早已作为常见病原体为人所知[7]，美国实验室和临床标准学会（CLSI）在近年才发布关于检测气单胞菌的操作指南[8]。CLSI推荐使用MH琼脂进行K-B纸片法测定抗生素敏感性。虽在一些菌种中发现了对某种抗生素的特异性敏感，但对于这个结果的研究不够充分，所以学界目前认为分离株对抗菌药物的敏感性似乎与菌种无关[9]。

本研究选取10类共13种常见抗生素，对102株河北省水产技术推广总站提供的2020—2021年分离自河北省多个地区淡水鱼样品的气单胞菌进行K-B纸片法药物敏感性实验，研究耐药表型相关耐药基因，分析菌株产生耐药性的原因，为河北省淡水鱼气单胞菌的合理用药和病害防治提供指导。

1材料与方法

1.1试剂

实验主要试剂见表1。

1.2气单胞菌药物敏感性实验

使用大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853作为质控菌株。将受试菌株接种于LB培养基或脑心浸液琼脂过夜培养，挑取单菌落直接重悬于0.9%生理盐水制成菌悬液，将浓度矫正为0.5麦氏浊度，均匀涂布于MH琼脂培养基，28 ℃倒置培养18～24 h。使用游标卡尺记录抑菌圈直径。参考CLSI2020指南，确定气单胞菌耐药表型并统计分离株耐药种类数据。抗生素判定折点见表2。统计抗生素耐药种类数据。

1.3耐药基因型分析

将102株受试菌株，接种于适量LB液体培养基或脑心浸液肉汤30 ℃、180 r/min过夜培养，4 ℃，10 000 r/min离心1 min收集菌体，使用EasyPure Genomic DNA Kit提取基因组DNA作为模板保存于-20 ℃冰箱备用。参考文献[10-11]合成多种耐药基因引物，使用PCR方法检测各类耐药基因在该耐药表型下的携带情况，

引物信息见表3。无菌水代替模板作为阴性对照。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳120 V、30 min，产物使用凝胶成像系统拍照。统计耐药基因检出率，得到耐药表型和耐药基因型符合率，分析气单胞菌对不同种类抗生素产生耐药性的原因。

2结果与分析

2.1药物敏感性实验

整理抑菌圈直径，比对CLSL2020指南得到102株受试菌株对13种常见抗生素的耐药情况，见表4。分离株对抗生素耐药种类数据见表5。

由表4可以看出，102株受试菌株对13种抗生素表现出不同的耐药率，其中对阿莫西林的耐药率最高，高达92.2%;对四环素耐药率较高，耐药率为18.6%;一代头孢菌素类头孢拉定耐药率为13.7%，但中度敏感率高达58.8%，但对头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟三种抗生素均不耐药，且只有一株对头孢呋辛中度敏感。值得一提的是，这三种药分别为第二代、三代、四代头孢菌素。对复方新诺明（4.9%）、美罗培南（8.8%）、氟苯尼考（9.8%）呈现出不同程度的耐药。其中仅有2（2.0%）株耐氨曲南，1（10%）株中度敏感;3（29%）株耐阿卡米星，1（1.0%）株中度敏感;1（1.0%）株耐多黏菌素B，2（2.0%）株中度敏感。产生稀有耐药性的原因可能为表达了抗菌剂外排泵基因qacE△1。所有受试菌株均对阿莫西林不敏感，推测气单胞菌对阿莫西林天然耐药，需要进一步研究其耐药基因表达情况。耐药种类统计数据表明不同分离株对1～7种抗生素产生耐药性，耐药表型较为丰富。多重耐药菌指对三种或三种以上抗生素产生耐药的细菌，本研究共获得44株多重耐药菌。

2.2耐药基因PCR产物电泳检测

检测各个菌株耐药表型对应的耐药基因。检测所有多重耐药菌的氨基糖苷类耐药基因ant（3”）-Ⅰ和获得性抗菌剂外排泵基因qacE△1。部分电泳结果如图1所示。

2.3耐药基因型分析

共检测11种7类耐药基因，检出率见表6。

除磺胺类sul3基因和酰胺醇类catA7基因以及喹诺酮类oqxB基因3个耐药基因未扩增成功，其余8种耐药基因均扩增成功。由扩增结果可知，102株细菌均检出TEM基因，与先前推测的气单胞菌对阿莫西林天然耐药相符合。

在18株耐复方新诺明（SXT）的菌株中，其中9株扩增出磺胺类耐药基因sul2，与耐药表型符合率为50%;在11株耐药谱含氟苯尼考（FLR）的菌株中，8株扩增出耐药基因floR，与耐药表型符合率为72.7%。

在20株耐四环素（TCY）的菌株中，tet（A）、tet（B）、tet（E）检出数分别为15（75%）、6（30%）、8（40%）。

44株多重耐藥菌中，10株检出氨基糖苷类耐药基因ant（3”）-Ⅰ，检出率为22.7%。其中3株细菌药敏试验中对阿卡米星（AMK）耐药，均检出该耐药基因，符合率100%;12株检出获得性抗菌剂外排泵基因qacE△1，检出率为27.2%。

3讨论

近年来，气单胞菌感染引起的人类健康问题和养殖业病害问题屡见不鲜，学界对其耐药性研究日渐深入。Ndi等[12]研究表明气单胞菌存在编码产生β-内酰胺酶的基因，所以对青霉素类、碳青霉烯类、单环-β内酰胺类等的耐药性增加。

Benthotage等[13]在虾夷扇贝中分离得到多株气单胞菌，报道对黏菌素、万古霉素、克林霉素、红霉素、利福平等抗菌药物耐药。Alcaide等[14]从临床和水及鳗鱼分离的205株气单胞菌中33（16.1%）株对喹诺酮类具有耐药性，Wimalasena等[15]报道从宠物海龟中分离得到耐药气单胞菌，提示宠物是人类感染气单胞菌的途径之一;Goni-vrriza等[16]在西班牙Arga河以及城市污水中分离获得气单胞菌110株，抗生素敏感性试验结果表明高达72%的菌株对喹诺酮类抗生素萘啶酸产生抗性，另外产生较高耐药性的抗生素是四环素（21%）和复方新诺明（14%），对氯霉素、β-内酰胺类和氨基糖苷类的耐药性较弱（≤5%），此外他们认为耐药菌株可以通过污水传播到多种环境中。Odeyemi等[17]对53株分离自马来西亚马六甲市的气单胞菌进行耐药性检测，对四环素（100%）、卡那霉素（5.7%）、庆大霉素（57%）和土霉素（24.5%）耐药。这与本研究四环素（186%）耐药情况差异较大，推测原因为河北地区和马来西亚马六甲市抗生素使用情况不同，环境压力也不同，造成了不同的耐药性情况。

本研究中从河北不同淡水鱼养殖场分离获得多重耐药菌44株，获得率为43.14%，属中等程度多重耐药情况，反映了可能存在抗生素使用不合理的现象。102株受试菌对阿莫西林耐药率接近100%，在养殖过程中应禁止使用该类抗生素;对四环素、头孢拉定、美罗培南、氟苯尼考、复方新诺明等不同类型抗生素产生不同程度耐药性，提示可能发生的耐药流行情况，为河北淡水鱼养殖行业制定合理抗生素使用计划提供理论依据。

参考文献：

[1] ZHANG X P，YU X M.Research progress on drug-resistant bacteria[J].International Journal of Sciences， 2019，8（6）：1-5.

[2] CATTOIR V，POIREL L，AUBERT C，et al.Unexpected occurrence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in environmental Aeromonas spp.[J].Emerging Infectious Diseases， 2008，14（2）：231-237.

[3] LIBISCH B， GISKE C G，KOVCS B，et al.Identification of the first VIM metallo-beta-lactamase-producing multiresistant Aeromonas hydrophila strain[J].Journal of Clinical Microbiology，2008，46（5）：1878-1880.

[4] PIOTROWSKA M， POPWSKA M.Insight into the mobilome of Aeromonas strains[J].Frontiers in Microbiology，2015，6：494.

[5] CARNAHAN A M，CHAKRABORTY T，FANNING G R，et al.Aeromonas trota sp. nov.， an ampicillin-susceptible species isolated from clinical specimens[J].Journal of Clinical Microbiology，1991，29（6）：1206.

[6] WEI C K， PUAH S M， KOH T H，et al.Comparison of clinical isolates of Aeromonas from Singapore and Malaysia with regard to molecular identification，virulence，and antimicrobial profiles[J].Microbial Drug Resistance，2018，24（4）：469-478.

[7] FERNáNDEZ-BRAVO A，FIGUERAS M J.An update on the genus Aeromonas：taxonomy， epidemiology， and pathogenicity[J].Microorganisms，2020，8（1）：129.

[8] RENNIE R P，TURNBULL L，BROSNIKOFF C，et al.First comprehensive evaluation of the M.I.C. evaluator device compared to Etest and CLSI reference dilution methods for antimicrobial susceptibility testing of clinical strains of anaerobes and other fastidious bacterial species[J].Journal of Clinical Microbiology，2012，50（4）：1153.

[9] OVERMAN T L， JANDA J M.Antimicrobial susceptibility patterns of Aeromonas jandaei， A. schubertii， A. trota， and A. veronii biotype veronii[J].Journal of Clinical Microbiology， 1999，37（3）：706-708.

[10] 糜祖煌， 陆亚华.氨基糖苷类修饰酶及其基因检测[J].现代实用医学，2004，16（1）：3.

[11] 赵敏.四川地区斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌的耐药性以及耐药基因检测分析[D].雅安：四川农业大学，2013.

[12] NDI O L，BARTON M D.Incidence of class 1 integron and other antibiotic resistance determinants in Aeromonas spp. from rainbow trout farms in Australia[J].Journal of Fish Diseases，2011，34（8）：589-599.

[13] BENTHOTAGE C，HOSSAIN S，SEPALA D P，et al.Aeromonas spp. from marketed Yesso scallop （Patinopecten yessoensis）：molecular characterization，phylogenetic analysis，virulence properties and antimicrobial susceptibility[J].J Appl Microbiol，2019，126（1）：288-299.

[14] ALCAIDE E，BLASCO M-D，ESTEVE C.Mechanisms of quinolone resistance in Aeromonas species isolated from humans， water and eels[J].Research in Microbiology，2010，161（1）：40-45.

[15] WIMALASENA S，SHIN G W，HOSSAIN S，et al.Potential enterotoxicity and antimicrobial resistance pattern of Aeromonas species isolated from pet turtles and their environment[J].Journal of Veterinary Medical Science，2017，79（5）：921-926.

[16] GONI-URRIZA M，CAPDEPUY M，ARPIN C，et al.Impact of an urban effluent on antibiotic resistance of riverine Enterobacteriaceae and Aeromonas spp.[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66（1）：125-132.

[17] ODEYEMI O A，AHMAD A.Antibiotic resistance profiling and phenotyping of Aeromonas species isolated from aquatic sources[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2017， 24（1）：65-70.

Antibiotic resistance of Aeromonas isolated from fish in Hebei Province

YU Zixiao1，TIAN Yang2，LI Quanzhen2，ZHAO Baohua1，CHEN Jiale1，LI Qingyang1

（1.Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China;2.Hebei Fisheries Technology Extension Center，Shijiazhuang 050035，China）

Abstract：To investigate the drug resistance of Aeromonas spp. isolated from fish raised in Hebei Province，13 kinds of antibiotics were selected， drug susceptibility experiments were performed by K-B disk diffusion method on 102 isolated freshwater fish Aeromonas spp.，and PCR was used to detect the corresponding drug resistance genes.These isolated Aeromonas spp. showed different resistance rates to 13 antimicrobial agents，and showed resistance to 1 to 7 of them.A total of 44 strains of multi-drug resistant bacteria were obtained， and abundant drug-resistant phenotype was found in different strains.The resistance rate of the isolated Aeromonas spp. to amoxicillin was as high as 92.2%， the resistance rate to tetracycline was 18.6%; the resistance rate to cefradine was 13.7%， and no resistant was found to cefuroxime， ceftazidime， or cefepime.The results of resistance gene detection were not fully consistent with the resistance phenotype.

Key words：Aeromonas spp.; antibiotic resistance; multi-drug resistant bacteria

（收稿日期：2022-03-04）

基金項目：河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队资助（项目编号：HBCT2018180207）。

作者简介：于子箫（1996.12-），男，硕士研究生，研究方向：分子细菌学。E-mail：435012821@qq.com。

通信作者：李清扬（1992.6-），女，讲师，研究方向：食源性致病微生物学。E-mail：qingyangli@hebtu.edu.cn。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.05.001