磷对盐碱胁迫下棉花离子平衡及相关调控基因的影响

孙嘉璘，侯振安

（石河子大学农学院农业资源与环境系，新疆石河子 832003）

盐胁迫是生态环境和人类健康的主要威胁，会降低作物产量并影响农业用地[1-2]。盐胁迫会使植物产生盐离子毒害和养分失衡，导致生理代谢紊乱、生长受抑、产量和质量降低，严重时甚至致死[3]。碱胁迫比盐胁迫对植物的影响更为严重，这是因为根际的pH过高，直接导致Fe2+、Ca2+、Mg2+和H2PO4-沉淀，离子的吸收受到抑制、平衡受到破坏，干扰植物的各项生理代谢活动，致使盐分对植物的伤害作用增强[4-6]。盐胁迫和碱胁迫通常相伴而生，植物可通过各种生理及分子机制来适应盐碱胁迫环境，包括渗透调节、盐分外排、离子区隔化、活性氧清除、转录调控、信号转导等[7]。虽然不同作物适应盐碱环境的方式和机理有所不同，但通过离子吸收和区域化维持植物细胞内的离子平衡(离子稳态)是提高植物耐盐性的关键机制之一[8-9]。植物抗盐碱生理实质上就是矿质营养问题，应该从矿质营养角度去研究植物对不同离子的吸收、分配和调控机理[10]。因此，促进盐碱胁迫下植物对营养离子的吸收是提高植物耐盐碱性的关键[11]。

新疆是我国主要的商品棉生产基地，也是全国最大的盐渍土区，盐渍化耕地占灌区耕地总面积的37.72%[12]，在盐碱侵害下，土壤结构受到破坏，腐殖质淋失，通气、透水不良，严重影响作物生长。棉花属于中等耐盐作物，其盐分阈值为7.7 dS/m (土壤饱和电导率)，具有较高的耐盐性，但其产量仍然会受到盐分胁迫的不利影响[13]。资料显示，新疆棉花因受土壤盐碱胁迫的影响每年减产6.5×106kg，约占棉花总产量的9%[14]。因此，提高棉花耐盐碱性对于促进新疆棉花产业可持续发展具有重要意义。

磷参与植物许多代谢过程，包括能量转移、信号传导、有机物合成、光合作用和呼吸作用[15]。在农业生产中，磷被认为是仅次于氮的最缺乏必需营养元素。研究发现，适量磷素可促进盐胁迫下植物深层根系生长[16]。提高磷素水平能够促进盐胁迫下番茄、黄瓜、小麦、黑麦草等的生长，降低膜伤害，促进矿质元素和水分的吸收，维持钾离子稳定，减少钠离子积累，从而提高耐盐性[17-18]。较高pH的碱土会导致磷素有效性降低[19]，影响作物生长，合理地补充磷素，势必会缓解胁迫，进而提高作物的耐盐碱性。磷素介导植物耐盐碱性的机制较为复杂，目前还不完全清楚，且该领域还缺乏分子和基因水平的机制研究[20]。

因此，揭示磷素介导棉花耐盐碱机制对于通过合理施肥提高棉花耐盐碱性，促进新疆棉花产业可持续发展具有重要科学意义。本研究采用盆栽试验，研究喷施磷素对盐(NaCl)和碱(NaHCO3+Na2CO3)胁迫下棉花生长和离子组响应特征的影响，以及Na+转运相关基因表达的变化，探讨磷介导棉花耐盐碱性的机制，为合理施肥提高棉花耐盐碱性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种‘鲁棉研24号’。供试土壤来源于石河子大学农学院试验站农田，取土深度为0—30 cm。土壤类型为灌耕灰漠土，质地为壤土，有机质、碱解氮、有效磷和速效钾分别是14.9 g/kg、41.2 mg/kg、10.6 mg/kg和 248 mg/kg。

试验采用向供试土壤分别添加中性盐(NaCl)和碱性盐(NaHCO3+Na2CO3)，设置盐胁迫和碱胁迫两种土壤盐碱胁迫类型，并以未添加盐碱的供试土壤(原土)为对照。其中盐胁迫(NaCl)处理土壤NaCl添加量为0.3% (占干土重)；碱胁迫(NaHCO3+Na2CO3)处理为NaHCO3+Na2CO3(摩尔比1∶1)添加量为0.4% (占干土重)。试验开始前，将供试土壤自然风干、碾碎后过2 mm筛，按照试验设计将不同盐配成溶液喷洒在土壤表面(对照处理喷洒等量去离子水)，边喷边搅拌，混合均匀后保湿堆置1个月，确保土壤盐分达到平衡。处理后的土壤自然风干，碾碎过2 mm筛后备用。不同盐碱处理土壤的盐碱类型和盐碱度见表1。

表1 不同处理土壤盐碱情况Table 1 Saline and alkaline of soil under different treatments

1.2 试验设计

试验于2019—2020年在石河子大学农学院试验站玻璃温室进行。试验使用直径15 cm、高25 cm的塑料盆，按照1.25 g/cm3土壤容重每盆装风干土4.0 kg。试验采用盆栽试验，设置盐胁迫和碱胁迫，在2种胁迫下，分别设置3个磷酸二氢钾喷施浓度，分别为0 (P0)、0.5% (P0.5)、0.75% (P0.75)，同时，设置无盐碱胁迫且不喷施磷素对照。共计7个处理，每个处理重复6次，共42盆。试验中，供试磷源为KH2PO4，为避免喷施KH2PO4中K元素的影响，添加K2SO4使各处理K元素相同，P0处理喷施等量清水。棉花于7月23日播种，每盆播种15粒。出苗后，每盆施入尿素(N46%) 3.2 g和51%的硫酸钾(K2O，51%) 1.6 g。试验期间定期称重补水，保持土壤含水量在田间持水量的60%～80%。待幼苗长至“两叶一心”时定苗，每盆保留长势均匀一致的棉苗3株。三叶期(8月9日)进行第一次喷施处理，之后每隔7天喷施一次，共喷施5次。棉花出苗60天后(苗期)，进行样品采集。

1.3 样品采集与分析

每个处理随机采集6株棉花最新完全展开叶(约12片)，其中6片分装3支离心管，其余叶片装入自封袋，做好标记，置于装有冰袋的保温箱中，立即带回实验室，前者经液氮速冻后，置于-80℃超低温冰箱中贮存，用于K/Na转运相关基因表达量的测定；后者将叶片用锡箔纸包裹，立即放入液氮速冻，用于质膜透性和丙二醛含量的测定。剩余棉花幼苗整株采样，分成根、茎、叶3部分，蒸馏水洗净后晾干，用于棉花生物量和各器官离子含量的测定。

土壤电导率及pH采用pH/电导率双参数测量仪测定(MP522型，上海三信仪表厂)。生物量采用烘干法测定。采用Win RHIZO根系分析系统分析根系长度、根表面积等形态指标。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[21]测定。细胞膜透性采用电导法[22]测定。N含量采用凯氏法测定[23]，P、K、Ca、Mg、Na、Fe、Zn、S、Mn、Mo、Si、Cu、B 含量采用 ICP 等离子体发射光谱法测定。K/Na转运相关基因(GhSOS1、GhAKT1、GhVP1、GhNHX1)相对表达量采用比较CT法[24](△△CT)进行相对定量分析。使用试剂盒提取RNA，Thermo试剂盒反转录取得cDNA，以GAPDH作为内参基因，根据棉花各基因的非保守区设计特异性引物(表2)，进行荧光定量PCR扩增，检测每份样品目的基因和内参基因的Ct值(循环阈值)，每份样品3次重复，并且进行3次独立的试验。

表2 目的基因定量分析所用引物信息Table 2 Primers used for gene detection and qRT-PCR analysis

1.4 数据处理方法

为便于比较在不同盐碱胁迫类型下喷施磷素后棉花生长和离子含量的变化差异，棉花生物量(干重)、根长、根表面积和离子含量均采用相对指标表示，即盐、碱胁迫下的指标与对照之比。具体计算公式如下：

式中， BT为盐碱胁迫和施磷处理棉花生物量(g)；B0为对照处理棉花生物量(g)。

式中， RT为盐碱胁迫和施磷处理棉花根长(cm)或根表面积(cm2)；R0为对照处理棉花根长(cm)或根表面积(cm2)。

式中，离子相对含量为棉花不同器官(根、茎、叶)离子相对含量；CT为盐碱胁迫和施磷处理棉花各器官离子含量；C0为对照处理棉花各器官离子含量。

数据平均值和标准差计算采用Excel 2016软件，统计分析使用SPSS 17.0软件。数据的统计分析采用施磷和盐碱类型两因素方差分析(Two-way ANOVA)。当方差分析为P＜0.05为达到显著性水平，不同施磷处理间的差异性比较采用Duncan法，不同盐碱类型间的差异采用独立样本T检验法。聚类分析采用R语言分析软件。

2 结果与分析

2.1 相对生物量和根冠比

生长状况是反映棉花受盐碱伤害的最直观表现。盐胁迫下，喷施磷素对棉花相对生物量的影响见表3。P0.5(0.5%)、P0.75(0.75%)处理棉花整株相对生物量显著高于不施磷处理(P0)。与P0相比，P0.5和P0.75棉花整株相对生物量分别增加23.8%和34.7%。碱胁迫下，与不喷施磷素P0相比，喷施磷素P0.5、P0.75处理棉花整株相对生物量分别增加17.3%和21.1%，棉花根系相对生物量分别增加71.1%和91.7%。盐胁迫下，棉花根冠比随着磷施用水平的上升而降低，但碱胁迫下，变化趋势与盐胁迫相反。

表3 磷对盐和碱胁迫下棉花相对生物量和根冠比的影响Table 3 Effects of phosphorus on relative biomass and root-shoot ratio of cotton under salt and alkali stresses

2.2 根系形态

根系是作物吸收养分的主要器官，根长和根表面积在棉花吸收养分方面起着举足轻重的作用。图1显示，盐胁迫下，喷施磷(P0.5、P0.75)显著增加棉花根长，P0.5、P0.75处理棉花相对根长较P0处理分别提高55.5%、74.6%。碱胁迫下，喷施磷(P0.5、P0.75)对棉花相对根长无显著影响。盐胁迫下，P0.5、P0.75处理相对根表面积较P0处理分别增加33.2%和49.4%，但P0.5和P0.75处理间差异不显著。碱胁迫下，P0.5、P0.75处理的棉花相对根表面积分别较P0处理显著增加了26.7%和49.7%，P0.75显著高于P0.5(P＜0.05)。

图1 盐碱胁迫下喷施不同浓度磷素棉花相对根长和相对根表面积Fig. 1 Relative root length and relative root surface area of cotton as affected by P spray concentrations under salt and alkali stresses

2.3 磷对盐碱胁迫下棉花逆境生理指标的影响

相对质膜透性是观测细胞膜损伤程度最直观的指标。图2显示，盐胁迫下，P0.5、P0.75处理均显著降低了棉花叶片质膜相对透性，但P0.5和P0.75处理之间无显著差异；碱胁迫下，P0.75处理显著降低了棉花叶片质膜透性，其质膜透性显著低于P0和P0.5处理。总体来看，盐胁迫下喷施磷降低棉花叶片质膜相对透性的作用大于碱胁迫。

图2 盐碱胁迫下喷施不同浓度磷素棉花叶片的相对质膜透性和丙二醛含量Fig. 2 Relative plasma membrane permeability and malondialdehyde content of cotton leaves as affected by P spray concentrations under salt and alkali stresses

从图2看出，盐、碱胁迫下，P0.5、P0.75处理显著降低棉花叶片丙二醛(MDA)含量，且P0.5和P0.75处理之间没有显著差异(P＜0.05)。总体来看，喷施磷降低棉花叶片MDA含量的作用在盐胁迫和碱胁迫下没有显著差异。

2.4 磷对盐和碱胁迫下棉花离子含量的影响

盐和碱胁迫下，棉花离子组(14种)变化的层次聚类分析见图3。根据叶片中14个元素离子含量的变化聚成两类：第一类包括Mg、N、Ca、Na、Fe，总体上表现为盐胁迫棉花叶片含量显著高于碱胁迫；第二类包括B、K、S、Mo、Mn、P、Cu、Zn、Si，盐胁迫下的叶片含量显著低于碱胁迫，且喷施磷后，综合来看，盐和碱胁迫下，喷施磷均能显著降低棉花叶片中Na 含量，增加P、Cu、Zn、Si 含量，且盐胁迫下Na含量降低幅度及Cu、Si 含量增加幅度大于碱胁迫。茎秆中，第一类元素中的Ca、Mo含量随磷喷施浓度的提高，盐胁迫下总体呈增加趋势，但碱胁迫下变化不显著；第二类中的P、K、Mg、Cu、S、Mn、Na、B、N、Zn、Fe、Si含量，盐胁迫下随磷喷施浓度的增加显著降低，而碱胁迫下则明显增加(图3b)。根系中，盐胁迫下喷施磷Si含量显著降低，而碱胁迫下Si含量下降不显著；盐胁迫下N、Mn、Na、S含量显著增加，而碱胁迫下其含量显著降低；Ca、Zn、K、P、Fe含量在盐和碱胁迫下均显著增加，而Mg、Cu、B、Mo无显著变化。

图3 盐和碱胁迫下不同施磷处理棉花叶、茎、根离子组变化层次聚类分析Fig. 3 Hierarchical cluster analysis of changes in ion groups of cotton leaves, stem and root as affected by different phosphorus application concentrations under salt and alkali stresses

由图4可知，盐和碱胁迫下，施磷显著降低了棉花各器官中Na的含量，且显著促进K、Ca、Mg在各器官中的积累。盐和碱胁迫下，P0.75处理的叶、茎、根中K/Na值显著高于P0.5处理，P0.5处理又显著高于P0处理；叶、茎、根中的Ca/Na值叶以P0.75处理最高，其次是P0.5处理，但是盐胁迫和碱胁迫下处理间的差异显著性不同，在盐胁迫下喷施磷提高Ca/Na值的效果大于碱胁迫。

图4 盐碱胁迫下喷施不同浓度磷素对棉花各器官K/Na、Ca/Na、Mg/Na的影响Fig. 4 Effects of spraying different P concentrations on K/Na, Ca/Na, and Mg/Na of cotton organs under salt and alkali stresses

盐、碱胁迫下，喷施磷均显著提高了叶片、茎和根中的Mg/Na值，但P0.5和P0.75处理的效果在不同器官中互有高低，盐胁迫下全株Mg/Na值的平均值显著高于碱胁迫。

2.5 喷施磷素对盐和碱胁迫下棉花基因表达的影响

图5a显示，喷施磷素显著提高棉花叶片中GhSOS1基因(质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因)的表达量，但盐胁迫下P0.75处理显著高于P0.5处理，而碱胁迫下P0.75与P0.5处理之间无显著差异，在盐胁迫下喷施磷上调该基因表达量的平均效果显著高于碱胁迫。盐、碱胁迫下，喷施磷素均显著提高棉花叶片中GhNHX1基因(Na+区隔化基因)的相对表达量，且P0.75处理显著高于P0.5处理；但是喷施磷在盐胁迫和碱胁迫条件下上调该基因表达的效果无显著差异。

图5 磷对盐和碱胁迫下棉花GhSOS1、GhNHX1、GhAKT1、GhVP1基因表达量的影响Fig. 5 Effects of phosphorus on expression of GhSOS1, GhNHX1, GhAKT1, and GhVP1 genes in cotton under salt and alkali stresses

GhAKT1基因是K+通道基因。盐和碱胁迫下，喷施磷均能显著提高棉花的GhAKT1基因相对表达量，P0.5、 P0.75处理间差异均不显著。喷施磷在盐胁迫下上调GhAKT1表达量的效果显著低于碱胁迫(图5c)。

GhVP1基因是液泡膜质子转运焦磷酸酶基因。喷施磷可显著提高棉花叶片中GhVP1基因的相对表达量，盐胁迫下，P0.75处理效果显著高于P0.5处理，碱胁迫下，P0.75和P0.5处理之间无显著差异。喷施磷提高该基因表达量的平均效果盐胁迫下显著高于碱胁迫 (图5d)。

3 讨论

盐胁迫会在植物中引起生理缺水、离子毒害、氧化伤害等胁迫伤害，从而影响植物生长[25]。磷(P)不仅是植物生长所必需的矿质元素，而且也具有提高作物耐盐性的作用[26]。然而目前关于磷对盐胁迫、碱胁迫下植物耐盐机制差异的影响研究较少。本研究结果表明，盐胁迫下，喷施磷素可提高棉花各器官相对生物量，其中0.75% (P0.75)处理的促进作用最为显著。碱胁迫下，喷施磷素能显著增加棉花各器官生物量，但喷施不同浓度磷肥对棉花影响不显著。喷施磷对碱胁迫下棉花相对生物量的影响显著大于盐胁迫。分析施磷对盐胁迫下棉花根系形态变化的影响发现，施磷能显著增加棉花相对根长和相对根表面积，且高磷浓度(P0.75)各指标均显著高于低磷浓度(P0.5)。张少民等[27]也发现盐胁迫下，喷施磷素能显著促进棉花根系生长。根系相对生物量的增加，可能是根系中的高亲和钾转运蛋白(HKT)可以最大限度的截留蒸腾流中的Na+并隔离在根系中，促进K+释放，从而降低地上部分的Na+含量和增加K+含量[28]，最终提高抗盐性。碱胁迫下，喷施不同浓度磷肥棉花相对根长与对照无显著差异，进一步说明施磷对棉花根系的影响较弱。同时盐胁迫下，喷施不同浓度磷肥对棉花相对根表面积的影响不显著；但碱胁迫下，高磷浓度对棉花相对根表面积的影响比低磷浓度更明显。本研究发现，盐胁迫下，喷施磷可以显著降低棉花相对质膜透性，但其浓度对棉花相对质膜透性影响不显著。碱胁迫下，高浓度磷处理(P0.75)降低棉花相对质膜透性效果显著，表明喷施高浓度磷对棉花碱胁迫的缓解效果显著优于低浓度磷。2种胁迫下，施磷均能显著降低棉花丙二醛含量，但不同喷施浓度对棉花的影响不显著。

高盐环境可打破植物细胞中已形成的各种离子平衡状态[29]。孙景波等[30]研究表明，Na+的积累不仅抑制作物对大量元素(N、P、K、Ca、Mg 和 S)的摄取，而且还限制作物对微量元素(Fe、Cu、Zn、Mn、B 等)的吸收，限制了这些离子的生理功能。本试验对两种不同胁迫下棉花体内离子组的变化进行研究，共筛选出14个相关离子。研究发现，喷施磷素能显著降低盐、碱胁迫下棉花植株体内Na含量，增加棉花K含量，其中盐胁迫下Na含量的降幅高于碱胁迫。张永亮等[31]研究也表明，施磷能够降低植株体内Na含量。碱胁迫下，施磷显著降低棉花叶片Mn、Na、N含量，其他元素含量均呈增加趋势。说明施磷能促进棉花对元素的吸收，各器官中磷含量随着施磷量增加呈显著增加趋势。有研究表明，磷素有促进盐胁迫下沟叶结缕草(Zoysia matrella)Na+分泌，限制Na+往地上运输，降低叶片中Na+含量的作用，并随磷素水平的增加，叶片和根系中K+含量均呈上升趋势，叶片K/Na随着磷素浓度的增加而增加[32]。但也有研究认为，盐胁迫下增加磷素使大豆(Glycine max)体内Na+的含量增加，致使耐盐性下降[33]。本研究表明，随着磷浓度增加，各器官中K/Na、Ca/Na、Mg/Na值增加，说明不同盐碱胁迫下，适量喷施磷可以促进K+、Ca2+和Mg2+的选择运输，从而改善各器官的离子平衡。这一方面是磷能促进根系的形成和生长，提高植物适应外界环境条件的能力。很可能施磷是增强棉花耐盐性的主要原因之一。

有研究表明盐胁迫下，棉花GhSOS1基因过量表达能显著促进Na+外排，提高棉花耐盐性[34]。本研究对不同盐碱胁迫下施磷对棉花体内离子变化的原因进行进一步探讨。研究发现，盐胁迫下棉花GhSOS1基因表达量随磷浓度增加显著提高，虽然碱胁迫下施磷也能促进GhSOS1基因表达，但不同喷施浓度处理间的差异并不显著。说明喷施磷能显著提高盐碱胁迫下棉花的GhSOS1基因表达量，但对盐胁迫下的影响大于碱胁迫。在液泡中，Na+的区隔化主要是能量的驱动下由液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX来完成的[35-36]。有研究表明， NHX过量表达可以提高棉花的耐盐性[37-38]。本研究发现，盐、碱胁迫下，GhNHX1基因表达量均随磷浓度增加显著提高。说明在适量的磷素喷施浓度范围内，施磷能显著提高棉花的GhNHX1基因表达量。盐、碱胁迫下植物维持体内 Na/K 稳态是抵御胁迫的主要方式之一，AKT1基因是 K 离子通过根系向地上部运输的主要通道基因[39]。在本研究中，施磷能显著提高盐、碱胁迫下GhAKT1的基因表达量，但P0.5和P0.75处理间差异均不显著。这表明盐胁迫和碱胁迫下，喷施磷均会促进棉花体内K+转运，但喷施磷浓度间差异不显著。VP是液泡膜上的一种重要质子泵，在调控细胞膨胀、H+电化学梯度、无机离子、有机酸和糖类等次级主动运输过程中发挥着重要作用[40]。有研究表明液泡膜跨膜电化学势增强，液泡中无机离子Na+和K+浓度增加耐盐性提高[41]。本研究发现，喷施磷能提高盐、碱胁迫下GhVP1的基因表达量。但对盐胁迫下的影响大于碱胁迫。通过对Na+转运机制进行研究发现，盐、碱胁迫下棉花耐盐的方式均包含Na+区隔化与Na+外排，但磷素对不同盐碱胁迫棉花体内相关基因表达量影响不同，说明磷素对盐胁迫和碱胁迫下棉花的耐盐机制的影响并不一致，需要进一步开展研究。本研究中，喷施磷素对盐和碱胁迫下棉花离子含量和基因表达的影响见图6，其结果可能有助于阐明磷对棉花耐盐性的影响机制。

4 结论

盐、碱胁迫下，叶面喷施磷能促进P、Cu、Si在棉花体内的积累，显著降低Na、N含量。盐、碱胁迫下喷施磷素棉花叶片的离子变化趋势相似，但喷施磷素对盐胁迫下棉花根系发育的促进作用大于碱胁迫。喷施磷素均能提高盐和碱胁迫下棉花GhSOS1、GhNHX1、GhAKT1、GhVP1基因表达量，并且盐胁迫下GhSOS1和GhVP1上调幅度较大，调控K的吸收和Na的转运能力较强，因而降低棉花叶片质膜相对透性和丙二醛含量，减少盐胁迫和碱胁迫对叶片细胞膜结构的破坏，进而促进棉花的生长。喷施磷素促进了盐碱胁迫下棉花对K的吸收，降低了Na的积累，从而维持了体内K/Na的离子稳态，提高了耐盐碱性。