lncRNA Gm4419靶向miR-204-5p调控LPS诱导的心肌细胞损伤机制

陈豫贤 于淑君 姜正明 代聚平 裴晓宁

(1南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管内科一病区，河南 南阳 473000；2郑州大学第一附属医院心血管内科五病区)

心肌梗死(MI)的发病率和死亡率逐渐升高，全球每年有超过700万人经历MI，死亡率大约10%，20%的存活患者可能在发病的第1年发生第2次心血管事件〔1〕。研究MI引起的心肌细胞损伤的机制，对MI的治疗具有重要意义。研究表明，非编码RNA包括miRNA、lncRNA和circRNA在心血管疾病特别是MI的病理生理过程中具有重要作用，调节心肌细胞凋亡、炎症、血管生成和纤维化等过程〔2〕。有报道显示，lncRNA Gm4419在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小胶质细胞〔3〕、创伤性星形胶质细胞损伤〔4〕和高糖诱导的系膜细胞〔5〕中表达上调，与细胞损伤、凋亡、炎症因子的表达有关。lncRNA Gm4419在MI中的作用尚不清楚。miR-204-5p在促炎因子刺激的肾小管上皮细胞〔6〕、脑缺血大鼠模型和OGD诱导的脑微心肌细胞〔7〕、肾缺血再灌注损伤大鼠的肾组织〔8〕中下调表达，与炎症因子释放有关。基于以上研究结论和预测结果，本研究假设，在脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞损伤中lncRNA Gm4419可靶向调控miR-204-5p的表达影响LPS诱导的心肌细胞损伤，通过建立心肌细胞H9C2的LPS损伤模型，对假设进行验证，以期为心肌损伤修复提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠心肌细胞H9C2购自北京北纳生物；胎牛血清、DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶、LPS购自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qRT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、酶切-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体和抗GAPDH抗体购自英国Abcam公司；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；流式细胞仪购自BD公司，实时荧光(PCR)仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将H9C2细胞培养于含有10 %胎牛血清、100 U/ml青霉素和10 mg/L 链霉素的DMEM高糖培养基中，培养条件：饱和湿度、37℃ 5%CO2恒温密闭培养箱中培养。隔天换培养液，当细胞生长至对数生长期，1∶3消化传代。

1.2.2细胞LPS模型构建 根据刘丹〔9〕建模方法构建MI体外细胞模型，以10 mg/L LPS处理H9C2细胞6 h，记为LPS组，H9C2细胞以正常DMEM高糖培养基培养，记为Con组。

1.2.3实验分组与处理根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明，在H9C2细胞中分别转染si-Gm4419、si-NC、miR-204-5p、miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-204-5p、si-Gm4419+anti-miR-NC，上述处理转染48 h后分别进行LPS模型建立，分别记为LPS+si-Gm4419组、LPS+si-NC组、LPS+miR-204-5p组、LPS+miR-NC组、LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p组、LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC组。处理结束后，进行各项指标检测。

后续lncRNA Gm4419与miR-204-5p靶向关系分析时，H9C2细胞分别转染miR-NC+野生型(WT)-Gm4419，miR-NC+突变型(MUT)-Gm4419，均记为miR-NC组；miR-204-5p+WT-Gm4419，miR-204-5p+MUT-Gm4419，均记为miR-204-5p组。另外H9C2细胞转染si-Gm4419、si-NC、pcDNA-Gm4419、pcDNA，分别记为si-Gm4419组、si-NC组、pcDNA-Gm4419组、pcDNA组，转染48 h后检测miR-204-5p表达。

1.2.4实时荧光PCR检测RNA的表达 Total RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，反转录合成cDNA，lncRNA Gm4419和miR-204-5p mRNA。lncRNA Gm4419上游引物：5'-GGAACCAAGCAGACCGAAGAC-3'， 下游引物：5'-CCCCAACCCACAGG-AACATAA-3'；miR-204-5p上游引物：5'-TTCCCTTTGTCATCCTATGCCT-3'， 下游引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.5流式细胞术测定细胞凋亡率 将各组H9C2细胞接种于6孔板中(5×105个细胞/孔)，培养24 h，收集并洗涤细胞2次，将细胞稀释为1×105个/ml，取300 μl 1×结合缓冲液重悬细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC和 10 μl碘化丙啶，室温避光15 min，再加入200 μl 1×结合缓冲液，上流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.6检测细胞中MDA、SOD和GSH-Px的含量 收集各组H9C2细胞，超声破碎细胞，取细胞破碎上清，按照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒说明书操作，检测细胞内MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.2.7双荧光素酶报告系统实验 将构建的含有lncRNA Gm4419与miR-204-5p预测结合位点的野生型(WT-Gm4419)和突变型(MUT-Gm4419)双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC或miR-204-5p共转染H9C2细胞。转染48 h，裂解细胞30 min，并离心收集上清，检测萤火虫相对荧光素酶活性。

1.2.8Western印迹检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和酶切caspase3 提取各组H9C2细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭2 h，加入一抗(Bcl-2抗体1∶2 000，Bax抗体 1∶2 000，酶切caspase3抗体 1∶1 000，GAPDH抗体1∶5 000)，4℃过夜孵育，洗膜3次，加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h，显影拍照，分析蛋白灰度。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1lncRNA Gm4419和miR-204-5p在LPS诱导的心肌细胞损伤中的表达 采用10 mg/L LPS处理H9C2 6 h，与Con组心肌细胞H9C2中miR-204-5p水平(1.01±0.07)相比，LPS组(0.44±0.04)显著降低(P<0.05)。

2.2干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的心肌细胞氧化应激的影响 与Con组相比，LPS组H9C2细胞中lncRNA Gm4419含量显著升高(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；干扰lncRNA Gm4419的H9C2细胞LPS诱导后结果相反，见表1。说明LPS可促进lncRNA Gm4419表达并促进H9C2产生氧化应激损伤；干扰lncRNA Gm4419可减轻LPS诱导的H9C2细胞损伤，提高细胞的抗氧化应激能力。

2.3干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的心肌细胞凋亡的影响 与Con组相比，LPS诱导的H9C2细胞凋亡率、凋亡蛋白Bax和酶切caspase-3表达显著升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.05)，；干扰lncRNA Gm4419表达组H9C2经LPS诱导后结果相反，见表1，图1及图2。说明干扰lncRNA Gm4419可抑制LPS诱导的H9C2细胞凋亡。

表1 干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的H9C2细胞氧化应激、凋亡及细胞损伤的影响

图1 干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的心肌细胞H9C2凋亡的影响

1～4：Con组,LPS组，LPS+si-NC组，LPS+si-Gm4419组图2 凋亡相关蛋白表达

2.4miR-204-5p过表达对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响 与Con组相比，LPS诱导的H9C2细胞中MDA含量表达量显著升高(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；而miR-204-5p过表达则结果相反，见表2，图3，图4。说明过表达miR-204-5p可减轻LPS诱导的H9C2细胞损伤并抑制细胞凋亡。

表2 miR-204-5p过表达对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响

1，2：LPS+miR-NC组，LPS+miR-204-5p组图3 凋亡相关蛋白表达

图4 细胞凋亡流式图

2.5lncRNA Gm4419靶向调控miR-204-5p的表达 通过LncBase Predicted v.2预测发现，lncRNA Gm4419的序列中含有与miR-204-5p互补的序列，见图5。双荧光素酶报告系统结果显示，过表达miR-204-5p可显著下调野生型WT-Gm4419组细胞中萤火虫荧光素酶相对活性(P<0.05)，见表3。pcDNA组miR-204-5p水平(1.00±0.09)显著高于pcDNA-Gm4419(0.56±0.05)；si-NC组miR-204-5p水平(1.01±0.08)显著低于si-Gm4419组(2.37±0.24，均P<0.05)

图5 lncRNA Gm4419序列中含有与miR-204-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-204-5p表达逆转了干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的心肌细胞损伤的作用 与LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC组相比，LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p组miR-204-5p、SOD、GSH-Px、Bcl-2水平均显著下降，而MDA、凋亡率、Bax及酶切caspase-3水平均显著上升(均P<0.05)。见图6、图7、表4。

1，2：LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC组,LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p组图6 Western印迹检测各组Bcl-2、Bax及酶切caspase-3水平

图7 抑制miR-204-5p表达逆转了干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的心肌细胞凋亡的作用

表4 抑制miR-204-5p表达逆转了干扰lncRNA Gm4419表达对LPS诱导的H9C2细胞损伤的作用

3 讨 论

LPS是革兰阴性菌细胞壁的重要组成，可引起炎症反应，高剂量的LPS可导致心脏功能障碍和心肌损伤，诱导心肌细胞产生炎症〔10〕。研究表明，lnc RNA在调节心血管正常生理状态和疾病状态中发挥重要作用，lncRNA Novlnc6与急性AMI有关，lncRNA Mhrt与心力衰竭有关，MALAT1和Tie-1-AS可以调节血管的生长和功能，还有一些lncRNA与心肌细胞的肥大、线粒体功能和凋亡有关〔11〕。有研究表明，lncRNA Gm4419在高糖诱导的系膜细胞中表达上调，可能通过核转录因子(NF)-κB信号通路调控系膜细胞中炎症因子的表达〔12〕。还有报道表明，lncRNA Gm4419在OGD/R诱导的小胶质细胞损伤〔3〕中和创伤性星形胶质细胞损伤〔4〕中高表达，与细胞损伤和凋亡相关。本研究结果说明lncRNA Gm4419在H9C2氧化损伤中发挥调节作用。miR-204-5p与肝细胞癌进展〔13〕、黑色素瘤的耐药〔14〕及乳腺癌细胞的EMT进展〔15〕有关。miR-204-5p通过靶向MEF2C和ERRγ抑制成肌细胞分化〔16〕。miR-204-5p在骨关节炎(OA)软骨细胞中表达下调，其高表达可促进了软骨细胞Ⅱ型和Ⅳ型胶原的表达，抑制软骨细胞的增殖〔17〕。研究还发现，miR-204-5p在大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血模型大鼠脑组织中表达下降，长非编码RNA MI相关转录本(MIAT)可靶向miR-204-5p调控高迁移率族蛋白(HMG)B1表达，减轻脑缺血后脑微血管内皮细胞(CMEC)损伤〔7〕。在小鼠心肌缺血再灌注(IR)损伤中，miR-204-5p通过KCNQ1OT1/miR-204-5p/LGALS3轴调控小鼠心肌IR损伤〔18〕。本研究结果说明miR-204-5p在心肌细胞损伤中发挥作用。