microRNA-200a干扰肺癌患者外周血B细胞IL-18的表达

王雪海 李钢 罗青松 谢家勇 甘崇志

(四川省医学科学院·四川省人民医院胸外科，四川 成都 610072)

肺癌的发病率在世界范围内呈现升高的趋势，病死率较高。经过多年的研究，不断优化早期筛查、手术方案与术后放化疗，患者的5年生存率得以提升〔1〕，但预后生活质量较差。因此新治疗方法的研究仍然任重道远。人们从免疫学的角度对肺癌预后不良进行分析，认为患者的免疫细胞已经对肿瘤产生了耐受〔2〕。肿瘤免疫耐受指的是一些肿瘤细胞能通过某种机制摆脱患者免疫系统的监控而迁徙、转移，其生长不受机体控制。关于肿瘤细胞如何逃逸的，现在还没有很明确的机制。一些起到抗肿瘤作用的分子也参与了免疫耐受调控。白细胞介素(IL)-18是一种表现出抗肿瘤活性的细胞因子，能诱导干扰素(IFN)-γ合成、促进自然杀伤(NK)细胞进而增强化Th1型免疫反应〔3〕。部分长度18～22核苷酸的microRNA(miRNA)能调控细胞因子表达。miRNA-200家族在多种肿瘤中呈现表达下调的特点〔4〕，其功能类似于抑癌基因，与肿瘤的侵袭与转移表现出密切的关系，在胃癌中的研究较多，但在肺癌中的研究国内较少见。本研究探讨miRNA-200a干扰肺癌患者外周血B细胞IL-18的表达。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2018年5月至2019年5月在四川省人民医院就诊的非小细胞肺癌患者47例为研究组，其中男29例，女18例，年龄39～67岁，平均(53.28±6.23)岁，病灶直径1～6 cm，平均(3.6±0.12)cm。另随机选取同期体检的健康人群47例为对照组，其中男25例，女22例，年龄38～69岁，平均(54.06±5.82)岁。纳入标准：经过病理学诊断确诊为非小细胞肺癌；没有合并其他系统癌症〔5〕。排除标准：并发免疫系统疾病；近期服用过免疫抑制类药物。入选患者知情并同意本研究内容。两组一般资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性，研究经过医院伦理委员会批准。

1.2CD19B淋巴细胞的分离与培养 两组入院治疗第2天清晨，保持空腹，从肘静脉处抽取约30 ml外周血，采用密度梯度离心的方法分离血液中的外周血单核细胞(PBMC)。选用Mitenyi Bio-tech试剂盒，用免疫磁珠方法分离CD19B淋巴细胞，通过流式分析纯度超过98%后培养在RPMI1640培养液〔含10%胎牛血清、20 ng/ml anti-CD40抗体、1×105U/L青霉素，100 mg/L链霉素、2 mmol/L L-谷胺酰胺(Gln)〕，在37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48 h换液1次。将生长旺盛的细胞传代至6孔板中进行后续实验〔6〕。

1.3细胞中RNA的提取 用Trizol试剂盒(tiangen公司，货号DP121221)提取细胞中的总RNA。用Nanodrop检测RNA A260/280值≥1.8时，用反转录试剂盒(tiangen公司，货号KR106)，然后按照5 μl SYBR GREEN、1.4 μl cDNA、0.6 μl 5 μmol/L引物配制反应体系；放入实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪器中，条件：95℃(15 min)〔95℃(10 s)、59℃(20 s)、72℃(20 s)〕40个循环，72℃(5 min)。U6为内参，miRNA-200、IL-18相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.4miRNA-200a脂质体的构建 miRNA-200a质粒由华大基因合成。取磷脂酰胆碱100 mg、胆固醇100 mg、1，2-二油酰基卵磷酸钠100 mg，将3种粉末混合与4.5 ml氯仿中，带氯仿挥发后，取10 mg脂质薄膜加入500 μl生理盐水作对照组处理，研究组需多加0.5 mg质粒，混匀，60℃震荡15 min，三蒸水洗涤备用。

1.5向CD19B淋巴细胞中转染脂质体 在对照组培养液中加入10 μg/ml miRNA-200a脂质体与空白脂质体，培养24 h，弃培养液，加入新培养液，再加入1 μg/ml脂多糖(LPS)，处理48 h后提RNA检测miRNA-200a与IL-18表达量。

1.6荷瘤小鼠模型的构建 选择8周龄、体重19～21 g的雄性C57BALB/c小鼠，饲养在(23±2)℃、相对湿度40%～70%的独立通风橱中。肺癌细胞株KLN205购自中科院上海细胞研究所，培养于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，每日换液1次。取对数生长期的细胞，在小鼠背部皮下注射数目约为106个肺癌细胞，每日检测1次瘤体大小〔7〕。

1.7miRNA-200a脂质体对瘤体生长的影响 在实验进行的第0、4、8天，按照0.2 mg/只的剂量向荷瘤小鼠腹腔注射miRNA-200a脂质体或空白脂质体。每日检测1次瘤体大小，记录实验第12天的瘤体大小。

1.8培养液与荷瘤小鼠血清中IL-18的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(碧云天，货号PI553)检测培养液或血清中IL-18水平。采用尾静脉取血的方法收集小鼠血液，凝固后离心去上清液即为血清。应用酶标仪检测波长λ=450 nm处的吸光度值并借助标准曲线可得知培养液样本中的IL-18含量。

1.9统计学分析 将实时荧光定量PCR结果从电脑中拷贝出来，使用2-ΔΔCt法对结果进行分析〔8〕。采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1两组CD19B淋巴细胞中miRNA-200a与 IL-18表达水平比较 经过流式筛选，两组外周血细胞分离出的CD19B淋巴细胞纯度达到98%，满足后续实验要求。研究组外周血CD19B淋巴细胞中miRNA-200a及IL-8表达水平显著低于对照组(均P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组CD19B淋巴细胞中miRNA-200a与 IL-18表达对比

2.2转染脂质体后CD19B淋巴细胞中miRNA-200a与 IL-18 mRNA表达水平比较 在对照组CD19B淋巴细胞中转染miRNA-200a脂质体与空白脂质体并LPS诱导后，miRNA-200a脂质体组miRNA-200a及IL-8 mRNA表达水平均显著高于空白脂质体组(均P<0.05)，见表2。

2.3转染脂质体后荷瘤小鼠瘤体生长情况与血清中IL-18水平比较 实验第12天对荷瘤小鼠的瘤体生长情况进行检测，miRNA-200a脂质体处理组瘤体显著小于空白脂质体组(P<0.05)，miRNA-200a脂质体处理组血清中IL-18水平显著高于空白脂质体组(P<0.05)，见表3。

表2 转染脂质体后CD19B淋巴细胞中miRNA-200a与 IL-18 mRNA表达水平的对比

表3 转染脂质体后第12天荷瘤小鼠瘤体生长及IL-18水平的对比

2.4脂质体处理前后培养液中IL-18水平比较 处理前，研究组细胞培养液中IL-18水平〔(257.31±3.98)μg/L〕显著高于对照组〔(168.23±3.47)μg/L;t=10.906,P<0.05〕；脂质体处理后，miRNA-200a脂质体组培养液的IL-8水平〔(256.99±6.33)μg/L〕显著高于空白脂质体组〔(163.09±6.74)μg/L;t=11.285,P<0.05〕。

3 讨 论

肺癌有很多分类，其中非小细胞肺癌是最常见的一种，由于早期诊断缺乏特异性强的生物标志物，晚期容易转移至远处，即使5年生存率得到有效提升，但患者预后生活质量无法得到有效保障〔8〕。

IL-18是一种细胞因子，主要由巨噬细胞分泌并合成，IL-18能促进T淋巴细胞增殖，促使活化的T淋巴细胞产生IFN-γ；同时IL-18还能激活NK细胞，发挥NK细胞抗肿瘤的生物学作用〔9〕。通过构建不同的荷瘤动物模型，IL-18在乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、白血病、骨髓瘤等恶性肿瘤中起到一定的治疗作用。miRNA是一种真核生物细胞内源性的短RNA分子，长约20 bp。虽然miRNA不直接编码蛋白，但可通过直接作用于靶mRNA，也可与靶mRNA上3′端的非翻译区相互结合，以这两种方式来调控基因在转录后的水平〔10〕。研究表明，多种癌症的发生与miRNA有着密切的关系。除了家族遗传和一些证实的危险因素以外，miRNA在肺癌发展的作用受到众多研究人员的重视。肺癌由原发灶向周围的组织血管浸润侵袭并借助血液循环、淋巴循环可扩散至邻近或远处的组织器官，是引发患者病情加重或者是死亡的关键原因〔11〕。

miRNA-200a是最先被发现在免疫系统中发挥调控作用的miRNA，能抑制机体调节炎症反应，其正常水平的表达能防止炎症反应过度对机体的损伤。近些年的研究使miRNA-200a在调控固有免疫及适应性免疫中发挥了重要作用〔12〕。在肺部其他疾病的研究中，如吸入性肺损伤，当研究人员用IL-18处理细胞后，miRNA-200a表现出依赖时间与剂量的快速增长趋势〔13〕，说明在肺部相关疾病的免疫调控中miRNA-200a扮演了重要角色。本研究进一步说明了miRNA-200a与IL-18正相关。

在胃癌或胃肿瘤中，由于表达上皮的相关基因沉默或缺失，miRNA-200家族表达水平普遍下降。已经证明miRNA-200a与脉管瘤栓存在相关性，提示miRNA-200a可能与肿瘤的侵袭迁移相关〔14〕。大量研究表明，miRNA-200家族上皮间充质转化(EMT)、β-catenin/Wnt通路的抑制因子。在鼻咽癌中的研究证明了miRNA-200a能直接靶向作用于β-catenin蛋白、抑制其翻译，从而抑制β-catenin/Wnt通路〔15〕，但在胃癌中miRNA-200a是否遵循此调控方式还不得而知。在多种肿瘤细胞中，miRNA-200a表达下调能促使E盒结合锌指蛋白(ZEB)1/ZEB2表达上调，抑制E-cadherin合成，促进肿瘤细胞EMT的发生从而促进肿瘤细胞的侵袭。此外miRNA-200家族也能与转化生长因子(TGF)-β2发生作用，降低TGF-β2的表达进而抑制EMT〔16〕。已知TGF-β2是TGF-β信号通路中的重要信号分子，而TGF-β信号通路又能调控EMT发生，进一步证明了miRNA-200a与肿瘤相互作用的密切关系。

综上，miRNA有广泛的临床应用价值，与肿瘤密切相关的特异性miRNA，其编码序列的发现提供了癌症治疗的特异性的靶点。随着人们对miRNA的加工过程和其控制的基因的深入研究及生物信息学和miRNA基因芯片技术的发展，肺癌的发病机制将逐渐被阐明。