脂联素对子宫内膜癌KLE细胞株增殖和凋亡的影响

春莲 吴福林 吴伟乐斯 其勒木格 吴萨仁图雅 昂和利玛

(内蒙古民族大学附属医院 1妇科，内蒙 通辽 028000；2胸外科；3内蒙古科技大学包头医学院第一临床医学院；4内蒙古民族大学临床(蒙)医学院)

子宫内膜癌是临床上女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，约占30%〔1,2〕。近年来由于子宫内膜癌发病逐渐年轻化且发病率和死亡率逐年升高，已成为严重威胁女性生命健康和生存质量的危险因素〔3,4〕。子宫内膜癌常见的临床治疗方法是手术和激素疗法，但因子宫内膜癌细胞的浸润和转移能力较强致使患者的治疗效果较差，因此寻找更佳治疗方案势在必行〔5,6〕。研究报道脂联素(APN)对子宫内膜癌的发生发展有一定的抑制作用〔7〕，本实验研究以子宫内膜癌KLE细胞株为研究对象，从细胞增殖、细胞凋亡及其调控通路方面，探究APN对子宫内膜癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂与仪器 子宫内膜癌KLE细胞株购于南京科佰生物技术有限公司；RPMI1640培养液、96孔培养板、6空培养板、25 ml培养瓶和胎牛血清购于Gibco公司；抗菌素、胰酶购于北京鼎国生物有限公司；APN购于美国Sigma公司；抗人的B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、生存素(survivin)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)及蛋白激酶B(Akt)酶联免疫试剂盒购于南京建成生物有限公司；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购于北京百奥生物技术有限公司；Trizol和实时荧光定量试剂盒购于Thermo公司；引物由Invitrogen公司提供合成。酶标仪购于美国BIOTIC公司；实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)仪购于美国MJ Research公司。

1.2实验分组与给药 将购买的人子宫内膜癌KLE细胞株使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液置于25 ml培养瓶37℃ 5%CO2培养箱中培养，待传至第三代时分组接种于96和6孔培养板(每组设5个复孔)，实验分为4组：空白对照组、低剂量APN组(5 μg/ml)、中剂量APN组(10 μg/ml)、高剂量APN组(20 μg/ml)；2 h细胞贴壁后给药APN 5、10、20 μg/ml。

1.3方法

1.3.1CCK-8试剂盒检测细胞增殖 人子宫内膜癌KLE细胞株(96孔培养板)给药APN 5、10、20 μg/ml 48 h后(每组设5个复孔)，采用CCK-8试剂盒，每孔加入CCK-8溶液10 μl，继续37℃ 5% CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪(450 nm)检测。细胞增殖抑制率=(空白组OD值-实验组OD值)/空白组OD值×100%。

1.3.2Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡 参照1.3.1(6孔培养板)，消化收集每孔1×105细胞弃掉上清液，采用Annexin V-FITC试剂盒，每个收集管加入200 μl Annexin V-FITC重新混匀悬浮细胞，然后加入10 μl碘化丙啶(PI)液避光室温染色20 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.3凋亡相关蛋白含量检测 凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相关调控通路PI3K、PTEN、Akt的蛋白含量均采用酶联免疫吸附试验检测，设定空白、标准、待测孔，每个样品设3个复孔，操作严格遵循试剂盒步骤。

1.3.4凋亡相关因子和调控通路相关因子mRNA水平的检测 凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin及相关调控通路PI3K、PTEN、Akt的mRNA水平均采用实时荧光定量PCR检测，经过Trizol提取总RNA、反转录合成cDNA、实时荧光定量扩增PCR，用2-ΔΔCt计算mRNA目的基因相对表达水平，取Ct均值。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行χ2检验和t检验。

2 结 果

2.1不同剂量APN对子宫内膜癌KLE细胞株细胞增殖影响的比较 与空白对照组比较，低、中、高剂量APN组的细胞增殖抑制率均显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

2.2不同剂量APN对子宫内膜癌KLE细胞株细胞凋亡影响的比较 与空白对照组比较，低、中、高剂量APN组细胞凋亡率均显著升高且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表1。

表1 不同剂量APN对KLE细胞株细胞增殖抑制率和细胞凋亡率影响的比较

2.3各组凋亡蛋白含量比较 与空白对照组比较，低、中、高剂量APN组Bcl-2、survivin、PI3K、Akt蛋白含量均显著降低，Bax、Caspase-3、PTEN蛋白含量均显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表2。

表2 各组凋亡蛋白水平比较

2.4不同剂量APN对子宫内膜癌KLE细胞株凋亡相关因子和调控相关通路因子的mRNA水平的影响 与空白对照组比较，低、中、高剂量APN组Bcl-2、survivin、PI3K、Akt mRNA水平均显著降低，Bax、Caspase-3、PTEN mRNA水平均显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表3。

表3 不同剂量APN对KLE细胞株细胞凋亡和调控相关通路因子mRNA水平的影响

3 讨 论

子宫内膜癌患者发病多为早期发现，治疗比较及时且有效，预后较好，但发展中国家因为生活水平和医疗水平的局限性，其患者常发现较晚，因此死亡率要高于发达国家，给患者本人及亲属带来沉重的精神负担和经济负担〔8～11〕。子宫内膜癌的发生较为多见的原因是环境和基因因素，其发展多与细胞过度增殖分化、细胞凋亡减少及信号传导通路缺陷相关〔12,13〕。APN是脂肪细胞分泌的一种多肽型的激素蛋白，它与恶性肿瘤的发生密切相关，特别是对子宫内膜癌的发生发展有抑制作用〔14,15〕；CCK-8实验能检测细胞增殖分化情况；Annexin V-FITC实验能检测细胞凋亡率情况；Bcl-2、survivin是抑制凋亡基因，Bax、Caspase-3是促凋亡基因；PI3K/Akt信号通路中PI3K是原癌基因、PTEN是抑癌基因，Akt是二者下游的靶向效应分子〔1,16～19〕。本研究结果说明APN能抑制子宫内膜癌KLE细胞株的细胞增殖并促进细胞凋亡；通过抑凋亡基因和促凋亡基因的检测，明确APN能上调促凋亡基因的表达、下调抑凋亡基因的表达；通过刺激PTEN活化，能使PI3K去磷酸化抑制Akt活化，起到抑制肿瘤生长的作用。

综上，APN抗肿瘤的治疗效果，可能与抑制子宫内膜癌KLE细胞株的细胞增殖、促进细胞凋亡、上调促凋亡基因、下调抑凋亡基因及激活PI3K/Akt信号通路密切相关，且随剂量增加效果更为明显。