帕金森病患者血浆α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平与临床症状的相关性

明敬峰 魏红玉 张永进 刘平国 李晓静 吴毅杰 李瑞霞 蔡增林

(1南京医科大学附属苏州科技城医院神经内科，江苏 南京 215000；2连云港市第一人民医院神经内科)

α-突触核蛋白(α-synuclein)是一种在神经元中表达丰富由SNCA基因编码的由140个氨基酸构成小分子蛋白质。α-synuclein的降解障碍是帕金森病(PD)的主要病理特征，在遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等多种因素相互作用下，α-synuclein发生错误的折叠并在细胞内聚集不能及时降解进而导致多巴胺能神经元死亡〔1〕。正常生理状况下，神经元通过质量控制系统对α-synuclein的生成与降解整个过程进行监控，一旦其结构出现异常神神经元就会对其进行修复或将其清除。自噬-溶酶体途径(ALP)是神经元修复和清除异常蛋白的最主要途径之一〔2〕。神经元ALP一旦异常，就会引起细胞内有害蛋白的积累，造成神经元的损害，最终引起神经退行性疾病。微管相关蛋白1轻链(LC)3，是哺乳动物自噬相关基因(ATG)8蛋白的同源物，是第一个被发现定位于自噬体膜上的自噬体标记蛋白，是自噬体的重要组成部分，其含量的多少与自噬体数量正相关〔14〕，目前在人体内发现LC3 有三种亚型，分为 LC3a、LC3b、LC3c，可以通过它们表达水平推断细胞自噬水平〔3〕。钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)是一个广泛参与蛋白质的去磷酸化，细胞骨架稳态，基因调控，细胞增殖，分化和致癌等代谢过程的小分子蛋白质〔4〕。CacyBP/SIP可能对于维持微管稳态从而在自噬体形成及自噬体、溶酶体融合过程中起重要作用和通过调节降解自噬正性调节因子 P27 参与自噬的调节〔5〕。总之，目前关于PD的发病机制目前不是很清楚，也没有根治的药物，找到一种能早期诊断PD的生物学标志物及寻找一个针对PD药物治疗的新方向对PD诊断与治疗具有重要临床意义。本文旨在探讨PD患者外周血浆α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP与PD临床症状的相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取 2016年7月至2017年11月在连云港第一人民医院神经内科及门诊就诊并确诊为PD的患者47例为PD组，纳入标准：①年龄55～80岁住院病人；②受试者已了解并签署知情同意书，同意留取血标本及配合相关评估；③PD患者符合2015年由国际运动障碍协会(MDS)制定的帕金森病诊断标准。排除标准：①合并恶性肿瘤、肝炎、肾脏疾病或其他严重疾病者；②继发性帕金森综合征、脑炎、有重大脑血管疾病、颅脑外伤手术病史者；③存在严重代谢性疾病、药物中毒或重度抑郁等原因导致认知功能障碍者；④有PD家族遗传病史。本研究经南京医科大学伦理委员会审查批准。同一时间段内随机选取与患者组性别、年龄相匹配的健康体检者 25例作为对照组。其中PD组男28例、女19例，平均年龄(68.96±6.90)岁，对照组男14例、女11例，平均年龄(66.40±4.24)岁；两组年龄及性别无显著差异(P>0.05)。同时由同一位神经内科医师对PD患者组按临床症状进行Hoehn-Yahr分期(测评时，PD 患者都没有使用抗PD药物)，总共招募到Ⅱ期患者21例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。

1.2血浆中α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平检测 ①血浆样本采集。分别抽取PD患者和对照组正常人空腹外周静脉血2 ml，用柠檬酸钠抗凝，再以高速离心机以3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆，下层血清，将上层血浆置于-80℃冰箱冰冻待检，全部血浆样本同一批次相同条件下检测记录实验数据。②血浆α-synuclein蛋白水平检测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法按人Alpha-synucleinELISA试剂盒(ABCam公司，编号：ab210973)内说明书检测血浆α-synuclein蛋白水平：按试剂盒试剂说明书配制洗脱液、抗体混合物、标准品及样品稀释。标准品按要求配制一系列浓度，分别为0，282，421，632，948，1 422，2 133，3 200 pg/L。在酶标板上设置两列标准品孔，一列实验孔一列复孔，每列包括8个孔；按照试剂说明书向每孔中依次加入50 μl的标准品溶液和样品溶液。分别向每个孔中加入50 μl抗体混合物，轻轻温和混匀；用封口胶带密封酶标板，室温条件下在300 r/min摇床上孵育1 h后，轻轻甩去孔内液体，向每孔加入350 μl洗涤液，每次浸润1 min左右，共3次，最后一次洗完后，轻轻甩去孔内液体，将酶标板倒置，用吸水纸吸去残留的液体；分别向每孔中加入100 μl底物溶液，室温条件下在300 r/min摇床上孵育10 min(避光)；待到时间后，立即向每孔中加入100 μl终止液，终止颜色发展反应；加完终止液后立即用酶标仪在450 nm波长下测定各个孔的OD值，根据标准品浓度运用EXCEL2010绘制标准曲线，要求R>0.99，再根据公式计算出各样本浓度。③血浆LC3A蛋白水平检测。按人LC3A ELISA试剂盒试剂(RnD公司，编号：DY8558-05)说明书配制洗涤液、检测抗体、HRP缀合物、底物溶液及标准品溶液。标准品溶液按要求配制一系列浓度，分别为0.0，15.6，31.3，62.5，125.0，250.0，500.0，1 000.0 pg/L。在酶标板上设置两列标准品孔，一列实验孔一列复孔，每列包括8个孔；按照试剂说明书向每孔中依次加入100 μl的标准品溶液和样品溶液，用封口胶带密封酶标板，在室温条件下孵育2 h。分别向每个孔中加入100 μl检测抗体，轻轻混匀。用封口胶带密封酶标板，在室温条件下孵育2 h后，按照酶标板制备步骤3洗涤每孔；分别向每个孔中加入100 HRP缀合物溶液，在室温条件小孵育20 min；时间到后，立即向每孔中加入50 μl终止液，立即用酶标在450 nm波长下测定各个孔的OD值，根据标准品浓度运用EXCEL2010绘制标准曲线，要求R>0.99，再根据公式计算出各样本浓度。④血浆CacyBP蛋白水平检测。按人CacyBPELISA试剂盒试剂(Lifespa公司，编号：ls-f23970)说明书配制洗涤液、检测抗体、HRP缀合物及标准品。标准品按要求配制一系列浓度，分别为0.00，78.15，156.30，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00，5 000.00 pg/L。在酶标板上设置两列标准品孔，一列实验孔一列复孔，每列包括8个孔；按照试剂说明书向每孔中依次加入50 μl的标准品溶液和样品溶液，标准品溶液从低到高浓度依次加入，待测样品按照样本的编号顺序依次加入；分别向每个孔中加入100 μl抗体混合物，轻轻混匀。用封口胶带密封酶标板，37℃水浴温箱孵育90 min，轻轻甩去孔内液体；分别向每个孔中加入100 μl检测抗体，用封口胶带密封酶标板，37℃水浴温箱内孵育60 min；分别向每孔中加入100 μl HRP缀合物，用封口胶带密封酶标板，37℃水浴温箱内孵育30 min；分别向每孔中加入90 μl底物溶液，用封口胶带密封酶标板，37℃水浴温箱内孵育15 min后，立即向每孔中加入50 μl终止液，立即用酶标在450 nm波长下测定各个孔的OD值，根据标准品浓度运用EXCEL2010绘制标准曲线，要求R>0.99，再根据公式计算出各样本浓度。

1.3统计学分析 应用SPSS22.0软件进行t、χ2检验、方差分析、非参数检验、Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1两组血浆中α-synuclein蛋白水平比较 PD组外周血浆中α-synuclein蛋白〔(3 138.27±175.00)pg/ml〕明显高于对照组〔(2 899.48±409.34)pg/ml，t=3.459，P<0.05〕。

2.2两组血浆LC3a蛋白水平比较 PD组外周血浆LC3a蛋白〔(87.14±27.72)pg/ml〕明显低于对照组〔(114.87±46.77)pg/ml；t=-3.162，P=0.002〕。

2.3PD患者不同Hoehn-Yahr分级血浆LC3a蛋白水平比较 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血浆中LC3a蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，PDⅡ期患者血浆中LC3a蛋白水平〔(99.02±27.89)pg/ml〕明显高于PDⅢ期患者〔(82.47±23.65)pg/ml，P<0.05〕；PDⅢ期患者血浆中LC3a蛋白的水平明显高于PDⅣ期患者〔(56.88±12.22)pg/ml，P<0.05〕。

2.4PD患者血浆中LC3a蛋白水平与不同Hoehn-Yahr分期相关性 PD患者血清中LC3a蛋白水平与Hoehn-Yahr分期呈负相关(r=-0.457，P=0.001)。

2.5两组血浆CacyBP/SIP蛋白水平比较 PD组外周血浆CacyBP/SIP蛋白〔(139.74±34.57)pg/ml〕与对照组〔(144.47±38.44)pg/ml〕差别无统计学意义(t=0.532，P=0.596)。

2.6PD患者不同Hoehn-Yahr分级血浆中CacyBP/ SIP蛋白水平比较 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血浆中CacyBP/SIP蛋白水平比较，均无明显差异(P>0.05)。PDⅡ期患者血浆中CacyBP/SIP蛋白的水平〔n=21，(140.86±31.53)pg/ml〕与PDⅢ期患者〔n=21，(136.73±38.29)pg/ml〕比较，差异无统计学意义(P>0.05)；PDⅢ期患者血浆中CacyBP/SIP蛋白的水平与PDⅣ期患者〔n=5，(147.67±36.13)pg/ml〕比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

PD最早的病理特征主要集中在残存神经元内形成的嗜酸性路易小体(LB，其主要成分是α-synuclein)和黑色素的功能上〔6〕。α-synuclein是一种在神经元中表达十分丰富的蛋白质，主要由大脑黑质、海马及纹状体神经元表达。α-synuclein蛋白异常聚集是PD发生的重要因素之一，α-synuclein异常聚集会产生神经细胞毒性，引起特定脑区的细胞脱失，从而引起包括PD 在内的多种突触核蛋白疾病〔7〕。正常生理情况下，大脑神经元内的α-synuclein没有特定空间结构，当外界环境改变时，α-synuclein的空间结构就会随之发生改变，形成富含β-折叠的不可溶形式在神经元内集聚成寡聚体，进而形成路易小体损失神经元，最终造成多巴胺能神经元的死亡〔8〕。

近年来，国内外学者已经做了很多对于血浆中α-synuclein蛋白浓度与PD的相关性的研究，但是他们研究的结果并不一致。Lee等〔9〕在实验中，应用ELISA对105例PD患者及51例正常对照者血浆中α-synuclein蛋白含量进行检测，结果发现PD患者血浆α-synuclein蛋白含量明显比正常人高。Duran等〔10〕通过ELISA检测53例未治疗过PD患者、42例治疗过PD患者及60例正常对照者血浆中α-synuclein蛋白水平时，结果发现治疗组及未治疗组α-synuclein蛋白的水平比正常人高，治疗组及未治疗组α-synuclein蛋白的表达水平无明显变化。

对于当前不同的学者所测血浆α-synuclein蛋白浓度存在较大差异，考虑与民族遗传背景及环境不同有关，本研究为避免此情况出现，实验对象均为汉族，长期在本地区居住。本研究结果和Lee等〔9〕研究结果相同，显示出血浆中α-synuclein蛋白可能作为PD生物标志物，从而帮助临床医师对PD的诊断。同时也说明α-synuclein蛋白异常聚集是PD发生的重要因素之一，在发病前减少聚集的α-synuclein蛋白，减轻对神经元的损失，可有效地预防PD的发生。大量异常的α-synuclein蛋白在多巴胺神经元内积聚对其造成损害从而引起死亡被认为是造成PD发生的重要原因〔11〕。因此，未来我们可以通过研究药物抑制α-synuclein蛋白的异常聚集，从而阻止PD的发生，降低PD的发病率。总之，本研究结果为α-synuclein蛋白用于PD的诊断和开发针对其降解药物预防PD的发生提供了一个临床依据。

LC3是人类在真核细胞中发现的第1种自噬体膜蛋白，它是自噬体的重要组成部分，其含量的多少与自噬体的数量呈正相关〔12〕。Schmid等〔12〕通过人为干扰SIAH1基因后，结果发现LC3II的蛋白表达水平明显降低，LC3的mRNA水平减低，细胞自噬活性降低。在人体内目前发现LC3 有三种亚型，LC3a是其中之一，可以通过检测其表达水平可以推断出细胞的自噬水平。

本研究结果显示血浆中LC3a蛋白可能作为PD生物标志物，从而帮助临床医师对PD的诊断。同时也说明PD患者自噬水平较正常人下降，自噬参与PD的发生。血浆中LC3a蛋白参与PD病程的进展，可用于监测其病情的进展。本研究推测，PD患者的自噬水平下降，从而导致异常α-synuclein蛋白清除障碍，使其在神经元内积聚损失神经元造成死亡，最终导致PD的发生。由此来看，自噬在PD的发病机制中起着重要作用。通过药物增强PD神经元的自噬功能，清除神经元内有害物质，可以挽救濒临死亡的神经元，从而延缓PD病人病情的进展，改善其生活质量。

CacyBP/SIP是一种参与多领域和有多种功能的蛋白质，广泛参与细胞新陈代谢过程中，对细胞的细胞骨架重排、去磷酸化、泛素化、基因转录调控及细胞增殖分化等生化过程中起重要作用。CacyBP/SIP最初被确定为S100A6(calcyclin)靶标，后来被认定为Siah-1相互作用蛋白〔13〕。CacyBP/SIP在哺乳动物不同组织类表达，在神经系统内高表达〔14〕。Filipek等〔15〕在研究CacyBP/SIP在培养的神经元和年轻和老龄大鼠的脑神经元中的定位实验中，发现在幼年大鼠的神经元中CacyBP/SIP蛋白主要在神经元内胞体和突触内表达中，在老龄大鼠神经元中CacyBP/SIP则主要在神经元胞体表达。

目前对于CacyBP/SIP在神经变性退行性疾病研究较少。阿尔茨海默病(AD)患者脑组织中的Tau蛋白常存在过度磷酸化，是正常功能丧失的重要原因之一。Tau蛋白在微管蛋白系统的含量是最高的，而微管蛋白系统是神经元骨架的重要组成成分，对于维持细胞正常生理功能具有重要作用，CacyBP/SIP可以使tau蛋白磷酸化参与AD病理过程中。Wasik等〔16〕在研究AD患者的脑组织和具有AD的特征性AD模型的转基因小鼠实验中，发现在AD患者和AD模型转基因小鼠的大脑中，CacyBP/SIP几乎全部存在于神经元胞体中，并检测到AD患者脑组织中的Tau蛋白常存在过度磷酸化，说明CacyBP/SIP可能在AD病理中起重要作用。

本研究说明血浆中CacyBP/SIP不能用于PD的诊断。对于PD组患者于对照组血浆中CacyBP/SIP水平无差异，考虑其分子量大，不易通过血脑屏障进入血浆，关于其在PD中的可能作用，尚待更进一步的研究来证明。