结直肠癌组织CD151与MT1-MMP蛋白、mRNA表达及相关性

于秀文 刘婷 徐晨 李雪松 荣玮

(齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

结直肠癌(CRC) 发病率居全部恶性肿瘤的第3位、病死率居第5位〔1〕。CRC发生是一个复杂过程，在此过程中癌细胞与肿瘤微环境多种成分相互作用。CD151属于四跨膜蛋白超家族(TM4SF，也称tetraspanin)成员，具有连接膜内外信号通道，促进tetraspanin信号网络中结合蛋白，参与和调节细胞生长、黏附、迁移、侵袭及信号传递等多种功能〔2,3〕。CD151在消化系统肿瘤中差异表达与肿瘤转移、预后密切相关〔4〕。膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)是一种影响肿瘤转移及进展的重要蛋白酶〔5,6〕，通过激活基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13等或直接降解肿瘤细胞周围间质并加速血管生成。文献报道〔7〕内皮细胞连接处，MT1-MMP与CD151及其相关伴侣整合素α3β1共定位。研究发现CRC CD151与整合素α3β1的表达具有协同作用〔8〕，但CRC组织CD151与MT1-MMP相互作用未见报道。本研究探讨CRC CD151与MT1-MMP蛋白及mRNA表达相关性及潜在作用机制。

1 资料和方法

1.1临床资料 选择2015年1月至2017年12月齐齐哈尔医学院附属医院原发CRC患者64例根治性切除的新鲜标本，术前均未经放疗、化疗等任何治疗。TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。所有切除组织在不影响病理诊断的前提下，立即无菌操作一次取材适量的新鲜癌组织并标记，取10 mg放入RNase Free EP管内，置于-80℃超低温冰箱内冻存，剩余组织用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色病理诊断证实均为CRC。对照组为对应远切端正常结直肠组织64例(距癌边缘>5 cm，经HE证实无癌细胞浸润)。

1.2主要试剂 鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗体浓缩液购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)RT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司。CD151、MT1-MMP1及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3免疫组化 采用免疫组化二步法，切片常规脱蜡水化，3% H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶20 min，枸橼酸高压修复10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3 min×3次，一抗(鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗体，工作液浓度为1∶600)4 ℃冰箱过夜，次日取出恢复室温后，依次滴加反应增强液，酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，室温各孵育15 min，PBS洗3 min×3次，DAB显色，苏木素复染，其余步骤按说明书进行。以PBS代替一抗作阴性对照，胃癌组织作阳性对照。

1.4qRT-PCR检测 取-80℃冻存的肠癌组织按Trizol试剂盒说明抽提组织总RNA，紫外分光光度法检测RNA的浓度及纯度，A260/A280比值在1.8～2.1之间，总RNA样品置-80℃保存备用。按照cDNA反转录反应试剂盒说明书进行反转录，获得所需cDNA。按照实时定量PCR试剂盒的操作步骤，进行PCR，PCR液配制在冰上进行，反应体系20 μl。CD151：正义链：5'-TGACTACATCAGCCTGCTG-3'，反义链：5'-AGCAGGATGAAGTACAGGC-3'；MT1-MMP1：正义链：5'-CCAATGTTCGAAGGAAGCG-3'，反义链：5'-GGGTGTAATTCTGGATGCAG-3'；GAPDH：正义链：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反义链：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'，共40个循环。

1.5免疫组化法判定 采用半定量积分法。所有切片采用盲法由两位病理医师独立阅片，CD151和MT1-MMP阳性产物呈棕褐色颗粒状，位于细胞膜和(或)细胞质。随机观察10个高倍视野，每个视野记数100个细胞，根据CD151和MT1-MMP阳性细胞的比率进行评定。(1)按阳性细胞的比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数≤5%；1分为5%～20%；2分为21%～50%，3分为51%～75%，4分为75%以上。(2)按染色强度评分：0分为细胞无棕色颗粒与背景一致；1分为细胞出现弱棕色或棕黄色颗粒；2分为出现中等强度棕色或棕黄色颗粒；3分为出现强棕色或棕黄色颗粒。(3)总积分=阳性细胞的比率评分+染色深度评分：0～1分为阴性(-)；2分及以上为阳性(+)。

1.6qRT-PCR法判定 根据CD151和MT1-MMP基因扩增的CT值，以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法比较CT值。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验、Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1远切端正常黏膜与CRC CD151和MT1-MMP蛋白的表达 CD151蛋白阳性呈棕褐色颗粒状，远切端正常肠黏膜分布在上皮细胞基底面和外侧面的细胞膜，表达弱，而在CRC组织分布于细胞膜和(或)细胞质，呈弥漫强表达。远切端正常肠黏膜、CRC组织CD151蛋白表达阳性率(20.3%vs 73.4%)差异有统计学意义(χ2=36.267，P=0.000)。MT1-MMP蛋白阳性呈棕褐色颗粒状，位于细胞膜和细胞质，在正常肠黏膜表达较弱，而在CRC组织和间质中弥漫分布，呈强表达或仅在间质强表达(图1)。远切端正常肠黏膜、CRC组织MT1-MMP蛋白表达阳性率(17.2% vs 62.5%)差异有统计学意义(χ2=27.412，P=0.000)。

2.2CRC CD15蛋白与MT1-MMP蛋白表达与临床病理因素的关系 CRC组织CD151和MT1-MMP蛋白表达与患者年龄、性别、发生部位及肿瘤最大直径无相关性，与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。CD151与CRC的分化程度有关，见表1。

2.3CRC CD151与MT1-MMP蛋白表达的相关性 64例CRC中CD151、MT1-MMP蛋白表达均阴性13例，阳性36例，CD151阴性MT1-MMP阳性4例，CD151阳性MT1-MMP阴性11例。两者呈正相关(r=0.496，P=0.000)。

2.4CRC CD151和MT1-MMP mRNA表达 远切端正常黏膜CD151和MT1-MMP mRNA相对表达水平(0.780 9±0.092 89、0.567 5±0.067 98)显著低于CRC(4.221 6±0.320 14、3.937 2±0.310 33；均P=0.000)。

图1 远切端正常黏膜与CRC CD151和MT1-MMP蛋白表达(免疫组化二步法，×200)

2.5CRC CD151和MT1-MMP mRNA表达的相关性 CRC组织CD151和MT1-MMP mRNA的表达呈正相关(r=0.784，P=0.000)，见图2。

图2 CRC CD151和MT1-MMP mRNA表达相关性

3 讨 论

CD151是外泌体蛋白中可作为肿瘤标志物的跨膜蛋白〔9〕，定位于人染色体11p15.5，全长1 443 kb，编码253个氨基酸，由一大一小2个细胞外环和2个短的细胞内尾端构成，大的细胞外环与多种整合素相结合，将整合素接到的各种生物信号转导到细胞内的重要结构基础。CD151蛋白在多种癌细胞表面都有较高表达，并与肿瘤恶性进展、预后及治疗等密切关系〔2〕。Sandfeld-paaulsen等〔10〕研究认为外泌体CD151可作为检测肺癌的标志物。本研究结果结果表明CRC CD151 mRNA高于远切端正常黏膜，与CD151蛋白表达结果相一致，提示CD151基因参与了CRC的发生、分化，并与侵袭及转移密切相关。文献报道〔11〕CD151是TM4SF中与肿瘤侵袭转移关系最为密切的因子，能促进内皮细胞迁移和微血管增生，有利于肿瘤细胞的浸润和转移。

MT1-MMP是肿瘤外泌体重要的蛋白酶〔12〕，基因定位于14q11，由10个外显子和9个内含子组成，编码582个氨基酸。MT1-MMP在肿瘤发生发展及侵袭转移中发挥重要作用。研究认为MT1-MMP在肺癌、胃癌、喉癌等多种恶性肿瘤中表达量和强度均上调，并和恶性肿瘤的分化程度、淋巴结转移及临床TNM分期关系密切〔13,14〕。本研究结果提示MT1-MMP基因在mRNA及蛋白水平均参与了CRC的发生。文献报道，肿瘤来源的外泌体富含促使细胞外基质降解的MMP，黑色素瘤和纤维肉瘤细胞来源的外泌体释放的MT1-MMP可降解胶原蛋白，促进恶性肿瘤转移〔15〕。

外泌体四跨膜蛋白在外泌体中形成功能性四跨膜蛋白复合物，四跨膜蛋白复合物包含各种蛋白质(CD82、CD151、Tspan8)及蛋白酶〔崩解蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、MMPs、MMP诱导剂(EMMPRIN)〕，在细胞运动、迁移、侵袭和转移形成中起重要作用〔16〕。文献报道CD151可直接与MMPs相互作用，调节其在细胞表面的定位、转运，溶酶体降解和蛋白水解活性〔17〕。在处于3D细胞外环境的侵袭性癌细胞中，发现CD151-整合素α3β1复合体通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路调节MMP-2和MMP-9的产生。苗杰等〔18〕研究食管胃交界部腺癌显示CD151与MT1-MMP蛋白均呈高表达，且CD151和MT1-MMP的表达呈正相关。本研究结果与文献结果一致〔18〕。提示二者可能具有协同作用，共同参与CRC的发生、侵袭和转移。结合研究结果，CRC CD151可能通过影响MT1-MMP及整合素α3β1促进CRC侵袭和转移〔8〕。Yaez-Mó等〔7〕研究发现在血管内皮细胞MT1-MMP通过其血红素结合蛋白结构域与CD151紧密结合，从而形成整合素α3β1/CD151/MT1-MMP复合物，敲除CD151基因直接影响MT1-MMP在亚细胞的定位和整合素α3β1的形成。但肿瘤中CD151与MT1-MMP具体作用机制及二者的相互作用尚不清楚，在外泌体、肿瘤细胞与肿瘤微环境这三者之间的关联作用还有待深入研究。