基于“异病同治”理论桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐的作用机制

赵忠伟 李妍 王纪伟 李冬梅

(长春大学特殊教育学院，吉林 长春 130022)

桂枝加龙骨牡蛎汤出自张仲景《金匮要略》，该书记载“夫失精家，少腹弦急，阴头寒……男子遗精，女子梦交，桂枝加龙骨牡蛎汤主之”原文中，因阴阳两虚导致的阴阳不交的男子遗精、女子梦交，是该方的主治之证。在老年人群中，不寐的病因病机主要是老年人的脏腑阴阳两虚导致的阳不入阴、心肾难以相交而致其不寐。“异病同治”理论是中医学治疗疾病的常用方法之一，即不同疾病的相同证型可用同一种治疗方法。基于上述，在“异病同治”理论的指导下，基于网络药理学的桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐作用机制展开新的研究。

1 资料与方法

1.1构建复方中药、成分、靶点基因网络图 将桂枝加龙骨牡蛎汤复方中的桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣输入到TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集上述中药活性化学成分，以药代动力学原理为依据〔2〕，药物口服利用率(OB)≥30%，类药性指数(DL)≥0.18为标准筛选符合条件的化合物〔3〕。在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb,org/batman-tcm/)数据库获取矿物类药物龙骨、牡蛎可信度高的蛋白作为候选靶点。同时在PubMed搜索相关文献对成分及靶点等进行有效补充，利用Uniprot(http://www.Uniprot.org/)数据库对上述预测靶点进行标准化处理。制作复方中药、活性化学成分、预测靶点基因数据，并将数据导入Cytoscape(V3.7.2)软件，应用软件的Network插件，对导入数据进行Degree(度值)分析后，构建中药、活性化学成分及预测靶点的可视化网络图。

1.2获取老年人不寐靶标基因 基于DisGeNET(人类疾病基因数据库)网站(https://www.disgenet.org/)与GenesCards(人类基因数据库)网站(http://www.genecards.org/)，以不寐的英文疾病名称“insomnia”为关键词，选择属性为“Homo sapiens”(智人)筛选疾病靶标。

1.3获取复方靶点——疾病靶标基因的交集 借助VENNY2.1在线数据分析作图网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)工具，将上述1.1、1.2中的药物靶点基因与疾病靶标基因进行交集，构建复方靶点基因与疾病靶标基因交集图。

1.4构建蛋白互作(PPI)分析网络图 将1.3中获得的中药靶点基因与疾病靶标基因的交集基因导入STRINGV11.5(https://string-db.org/)数据平台，利用Multiple Proteins by Names做PPI分析，Score值设置为最高0.9，其他均为系统默认值，再将该平台分析结果导入Cytoscape(V3.7.2)软件，经过Degree分析后，在Network插件做PPI可视化网络图。

1.5GO功能与KEGG富集分析 基于DAVIDV6.8生物信息学资源网站(https://david.ncifcrf.gov/)对筛选的核心靶点进行GO功能与KEGG富集分析〔4〕。在DAVIDV6.8网站中提交71个核心靶点基因，选择物种为“Homo sapiens”(智人)，选择P<0.05的分析结果，根据DAVIDV6.8数据库分析得到的GO功能与KEGG富集结果，在微生信线上服务平台网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)导入DAVIDV6.8分析数据做可视化处理〔5〕。

1.6药物-代谢产物-疾病靶点-KEGG通路-疾病的可视化网络构建 为更进一步说明桂枝加龙骨牡蛎汤“异病同治”治疗老年人不寐的作用机制，运用Cytoscape(V3.7.2)软件，将中药及其有效活性成分对应PPI网络筛选得到核心靶点及基因通路富集分析所得有效通路及疾病做可视化网络处理。

2 结 果

2.1复方中药的有效成分及预测靶点 本文共收集桂枝加龙骨牡蛎汤复方药物有效活性化学成分151种，其中桂枝7种、白芍13种、生姜5种、甘草92种、大枣29种、龙骨2种、牡蛎3种，合并去重后119种，预测目标靶点276种，桂枝加龙骨牡蛎汤复方各中药部分有效活性化学成分见表1。

桂枝加龙骨牡蛎汤成分与预测靶点之间作用关系见图1，图中绿色圆圈代表复方中药，不同颜色正六边形代表中药的有效成分，其中以A、B、C与数字组合的表示为多种中药共有的活性化学成分，蓝色菱形表示预测靶基因。

2.2疾病相关靶点收集 在DisGeNET和GenesCards数据库中以“insomnia”为关键词，在DisGeNE选取P值<0.05与老年人不寐相关的靶基因，在GenesCards数据库中以“Score”的中位数为界值，选取“Score”≥其中位数的基因作为老年人不寐相关的靶基因，两个数据库合并去重，共获得与老年人不寐疾病相关联靶标基因1 599个。

表1 桂枝加龙骨牡蛎汤药物部分有效活性化学成分

图1 复方各中药成分-预测靶点网络

2.3绘制复方预测靶点与疾病相关靶标韦恩图 将桂枝加龙骨牡蛎汤各中药成分的276个预测靶点与老年人不寐疾病1 599个相关靶标基因数据导入VENNY2.1线上服务平台，得到桂枝加龙骨牡蛎汤预测靶点与老年人不寐疾病相关靶标交集，共得到交集靶点71个。

2.4PPI分析与网络构建 将桂枝加龙骨牡蛎汤中中药活性化学成分预测靶点与老年人不寐疾病靶基因的71个交集靶点导入STRING蛋白互作分析平台，得到PPI关系图，见图2，图中共有71个节点，每一个节点代表一个靶点蛋白，蛋白与蛋白之间的作用关系以直线连接的方式表示〔6〕，网络连接密度越高说明蛋白与蛋白之间的关系越密切，为进一步筛选核心蛋白提供了理论依据。在STRING数据库下载可在Cytoscape(V3.7.2)打开的并能作图分析的数据〔7〕，运用Cytoscape(V3.7.2)插件进行度值(Degree)分析，Degree越高说明该蛋白的关键性越强，其中蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤细胞坏死因子(TNF)、IL-10、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK3)、 低聚果糖(FOS)、雌激素(ESR1)、TP53、IL-1α、电压依赖性钙通道L型(CAV1)、缺氧诱导因子(HIF)1α的Degree≥7，故上述11个基因可能作为桂枝加龙骨牡蛎汤的核心靶点，见图3，图中按照Degree的分析结果，圆圈越大、颜色越深，越靠近中间代表其关键性越强。

图2 STRING数据库PPI网络图

图3 Cytoscape PPI可视化网络

2.5GO功能与KEGG富集分析 运用DAVIDV6.8数据库网站，选择物种为“Homo sapiens”，对11个核心靶标基因进行GO功能和KEGG富集分析，富集条件为P<0.05，其他项目默认原始设置，GO功能富集分析核心基因主要参与蛋白质结合、酶结合、以RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、DNA模板转录正调控、基因表达正调控及炎性反应等。KEGG富集分析得出桂枝加龙骨牡蛎汤异病同治干预老年人不寐主要凭借癌症通路、乙型肝炎、TNF肿瘤坏死因子通路及MAPK转运通路等通路完成。把上述数据结果导入微生信线上服务平台制作GO功能富集分析气泡图、KEGG富集分析柱状图，见图4、图5。图4横坐标代表基因数、纵坐标分别BP、CC、MF功能结果，圆圈越大则表示关联靶点基因数越多，随着P值由大到小，颜色由绿色向红色过度，图5横坐标代表通路中的基因数，纵坐标表示KEGG通路，颜色随P值的减小由蓝色向红色过度。

图4 GO功能富集分析结果

图5 KEGG富集分析结果

2.6中药-活性成分-靶点-KEGG通路-疾病的可视化网络构建 把KEGG通路分析筛选的核心通路、核心靶点基因、有效活性成分及其对应的中药，整理并构建中药、成分、靶点基因、通路与疾病关系数据，导入Cytoscape(V3.7.2)软件中，构建复方中药-活性成分-靶点基因-通路-疾病可视化网络图，见图6，图6中绿色圆形代表复方的中药，不同颜色的正六边形代表活性成分、蓝色菱形代表核心靶点，绿色三角形代表KEGG核心通路的部分通路，凹三焦形则表示疾病，复方中药、活性成分、靶点基因、通路、疾病之间的关系以直线连接。

图6 复方中药-成分-靶点-通路

3 讨 论

基于“异病同治”理论与网络药理学对桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐的机制分析，发现桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐的主要化学成分可能是槲皮苷、山奈酚、(+)-儿茶酸等 。槲皮苷其主要成分为槲皮素化学式为C15H10O7，是一种广泛存在自然界的植物次生代谢物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗菌及具有保护心血管作用。有研究〔8〕表明炎症因子IL-1、IL-6、IL-10在槲皮素的作用下，其表达量可被降低，进而可说明槲皮素具有抗炎的作用，同样有研究〔9〕表明，在急性痛风性关节炎大鼠模型中，槲皮素可降低炎症因子IL-6及TNF的表达而改善大鼠关节的肿胀程度。山奈酚又称山奈素或山奈黄酮醇，其分子式为C15H10O6，在可食用的植物中黄酮类化合物其位列第三，山奈酚的药理作用主要有抗抑郁、抗炎、抗氧化应激、抗脑缺血损伤、抗惊厥、抗痴呆等作用。近年有一项研究〔10〕表明山奈酚及衍生物具有抗炎作用，以脂多糖及大肠杆菌提取物干预BV-2小胶质细胞，使其产生促炎物质TNF-α、IL-6，前列腺素及亚硝酸盐，山奈酚及衍生物则可显著的降低炎症相关蛋白的表达。另一项对四叶草提取物的抗炎作用的研究中，通过高效液相色谱和飞行的时间色谱发现，四叶草的提取物中的山奈酚衍生物紫云英苷具有明显的抗炎作用〔11〕。(+)-儿茶酸又名(+)-儿茶素是茶叶的主要活性成分，可有效改善认知功能，调节细胞通路及细胞凋亡因子的表达，调节神经递质水平和炎症的发生等。

根据PPI分析蛋白激酶B(AKT)1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等可能为关键靶点基因。AKT1，是AKT信号通路的核心调控因子之一，控制细胞的生长与存活，有研究〔12〕表明：围绝经期非器质性失眠患者的肝郁分级与匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)及AKT信号通路(PI3K)/AKT信号通路调节下的PI3K、AKT、磷酸化(P)AKT的蛋白表达量及其基因含量、IL-1β、TNF-α水平均为中度正相关性。IL-6是细胞炎性因子，在人类的神经递质调节系统及免疫系统都有IL-6的参与，国外的一项研究〔13〕显示，在对失眠患者的血液监测时发现，随着失眠程度的改变，失眠患者血液中的IL-6的含量也随之发生改变，且与失眠的程度呈正相关。针刺联合足少阳胆经推拿对气郁质失眠患者，治疗后观察组患者血清IL-6、多巴胺(DA)水平低于对照组，而血清5-HT水平高于对照组，表明针刺联合足少阳胆经推拿可改善患者睡眠结构，改善其睡眠质量〔14〕。TNF在睡眠-觉醒周期的作用中，在睡眠中枢与觉醒中枢协同作用下，由内分泌、神经及免疫系统的共同参与完成。有研究〔15〕表明TNF可直接作用于下丘脑的上核神经元，通过影响神经、内分泌激素调节失眠。同样有实验表明TNF参与睡眠的免疫调节中有代表性的细胞因子，内源性的TNF含量变化随睡眠的变化而呈节律性的改变〔16〕。MAPK3是MAPK激酶的信号传导通路的重要组成部分，在细胞外刺激引起的细胞反应级联中起重要作用。有研究〔17〕指出阿尔茨海默病小鼠的血液中，常伴有MAPK表达的升高，当失眠及焦虑症状缓解后，MAPK的表达也随之降低。Scharfman等〔18〕认为ESR1可以通过作用于表达ER的GABA能中间神经元，促进邻近神经元脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，或者通过与位于BDNF基因上的ESR1反应元件相互作用．诱导BDNF的表达。同时，已有多项临床研究表明BDNF的神经营养功能参与了睡眠的自我平衡调节过程。根据GO富集分析结果显示，桂枝加龙骨牡蛎汤基于“异病同治”的理论基础治疗老年人不寐主要涉及与生物过程有关，主要涉及蛋白质结合、转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、DNA模板转录正调控等的生物过程。

KEGG通路分析结果得知，桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐可能与癌症通路、TNF通路、MAPK信号通路等通路有关，上述通路为AKT1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等核心靶点的主要通路。其中TNF信号转导通路是由机体重要的细胞因子TNFR-1和TNFR-2诱发的通路，包括细胞凋亡、细胞存活、炎症和免疫等作用〔19～21〕。目前越来越多研究推测免疫激活相关的细胞因子分泌与精神类疾病的密切相关，TNF、IL-1β等炎性细胞因子可通过激活下丘脑室旁核中含CRH神经元，促使腺垂体释放皮质醇信号通路(ACTH)，从而活化下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)，进而导致抑郁症。同时，HPA轴的失调也是失眠的机制之一。癌症通路与MAPK信号通路同样是TNF、AKT1及MAPK3等因子的主要通路，同样通过细胞的存活、炎症反应及免疫调节等生物过程，作用于神经调节系统，通过调节与失眠有关的神经递质5-HT及DA等物质干预失眠。

综上,本研究基于网络药理学技术，构建桂枝加龙骨牡蛎汤“异病同治”的理论治疗老年人不寐的方剂-中药-成分-靶点-通路-疾病的生物网络，发现桂枝加龙骨牡蛎汤119种入血成分，71个靶点可能与老年人不寐具有相关性，主要涉及60条相关通路，并根据大量文献分析，初步探讨了桂枝加龙骨牡蛎汤治疗老年人不寐的分子机制，体现了中医药组方多成分、多靶点、多途径的作用特色，为进一步开展探究老年人不寐的分子机制奠定了基础。