老年喉癌组织miR-362-3p、miR-217表达变化及其与肿瘤恶性程度相关因子的关联性

金辉 杨丽萍 刘莉 汪斌如 梁耕田

(武汉市第三医院耳鼻喉科，湖北 武汉 430000)

喉癌(LC)是临床常见头颈部恶性肿瘤之一，约占头颈部恶性肿瘤的20%〔1〕。据报道，LC已发展成仅次于肺癌的第二大呼吸系统高发癌，严重威胁人类生命健康〔2〕。有研究显示，LC发病可能与反复性胃食管反流、人乳头瘤病毒感染、遗传变异等因素有关，但具体发病机制尚未完全明确〔3〕。因此，积极探究LC发生发展相关分子标志物、作用机制对早期确诊、评估预后具有重要潜在临床价值。微小RNA(miRNA)是内源性非编码小RNA，通过调控下游靶基因可特异性发挥作用，临床已证实，其参与多种肿瘤发生发展过程，且在机体内多种体液内稳定表达，有望成为多种疾病分子标志物〔4〕。miR-362-3p是LC细胞中的c-Myc靶基因(MYCT1)下游调控基因，病理学研究显示，其在乳腺癌、肾细胞癌、胃癌细胞迁移、侵袭中发挥关键作用〔5〕。miR-217在LC组织中呈低表达状态，但其具体作用缺乏研究。本研究探讨老年LC组织miR-362-3p、miR-217表达及其与肿瘤恶性程度相关因子的关联性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2019年9月在武汉市第三医院手术切除的老年LC组织与癌旁正常喉组织标本作为LC组及癌旁正常喉组各114例，喉良性病变组织标本作为喉良性病变组(96例)。均经病理诊断确诊；符合LC诊断标准〔6〕；入组前未经放化疗，无手术禁忌；排除标准：继发性LC；伴其他原发性恶性肿瘤疾病者；合并全身感染性疾病者。本研究经医学伦理委员会审批通过。

1.2方法 (1)miR-362-3p、miR-217检测：取LC组织，同时取距离LC组织2 cm癌旁正常组织标本、喉良性病变组织标本，即刻置入液氮保存待检。以实时聚合酶链反应(PCR)技术测标本内miR-362-3p、miR-217表达，采取Trizol试剂提取细胞、组织内RNA，以miRNA反转录试剂盒反转为cDNA，转录条件：60 min 37℃，5 min 85℃，以U6作为内参，实时PCR测miR-362-3p水平。miR-217操作步骤同miR-362-3p，详细以试剂盒说明书为准；显微镜下随机选视野5个，并分别计数细胞，5个视野平均数作为最终结果。(2)血清肿瘤恶性程度相关因子检测：以非抗凝管取晨空腹静脉血3 ml，离心10 min(半径8 cm，转速3 500 r/min)取血清，保存至液氮待检。以酶联免疫吸附试验检测鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)、细胞角化素蛋白19片段(CYFRA21-1)、糖类抗原(CA)199、癌胚抗原(CEA)、胸苷激酶(TK)1水平。试剂及试剂盒为上海西塘生物科技有限公司提供，并由相同资深专科医师规范操作完成。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、Logistic回归分析、t检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1各组miR-362-3p、miR-217表达 LC组中miR-362-3p表达显著高于喉良性病变组及癌旁正常喉组，miR-217表达显著低于喉良性病变组及癌旁正常喉组(均P<0.05)，见表1。

2.2miR-362-3p、miR-217表达和LC组一般资料、临床病理参数的关系 miR-362-3p、miR-217表达与LC患者年龄、性别、组织分化程度之间无显著相关性(P>0.05)；临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移LC患者miR-362-3p表达显著高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者，而miR-217表达显著低于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者(均P<0.05)，见表2。

表1 各组织标本中miR-362-3p、miR-217表达对比

表2 LC组miR-362-3p、miR-217表达和一般资料、临床病理参数的关系

2.3LC发病有关影响因素的多元回归分析结果 以是否发生LC为因变量，将患者年龄、性别与组织miR-362-3p、miR-217为自变量实施Logistic回归分析，结果发现，组织miR-362-3p、miR-217均为LC发病的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 LC发病有关影响因素的多元回归分析结果

2.4LC组与喉良性病变组血清肿瘤恶性程度有关因子表达 LC组血清SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1表达显著高于喉良性病变组(P<0.05)，见表4。

表4 LC与喉良性病变患者血清肿瘤恶性程度有关因子表达比较

2.5miR-362-3p、miR-217表达与LC组血清肿瘤恶性程度有关因子关联性 miR-362-3p表达与LC组血清SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1水平呈正相关，miR-217表达与上述指标均呈负相关(P<0.01)。见表5。

表5 miR-362-3p、miR-217表达与LC组血清肿瘤恶性程度有关因子关联性(n=114，r/P值)

3 讨 论

近年LC患病率有升高趋势，尽管手术、放射及基因治疗技术不断进步，但喉功能保留率差，尤其是老年患者，5年生存率较低，早期发现癌变可疑迹象，并合理干预是改善预后的关键〔7，8〕。LC发生发展与众多肿瘤一样，是涉及多因素、多基因参与的一个复杂过程。

miR-217是一种重要miRNA，参与肿瘤发生、发展过程〔9〕。谢琳等〔10〕研究显示，miR-217能通过靶向丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路阻滞人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭。徐健等〔11〕证实，miR-217与长非编码沉默RNA MALAT1结合能抑制食管鳞状癌细胞增殖、迁移、侵袭。徐菲等〔12〕指出，miR-217可诱导胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因表达诱导卵巢上皮癌细胞凋亡，并抑制其恶性生物学行为，与卵巢癌病理分期、分级关系密切。但miR-217在LC发病发展中的具体机制，临床尚缺乏大量数据支持。本研究说明miR-217在LC发生、发展中扮演抑癌基因角色，可抑制LC恶性生物学行为。

miR-362也是miRNA家族主要组成部分，但临床报道，miR-362具有组织特异性，在不同肿瘤组织内作用不同，肾癌及乳腺癌内发挥抑癌基因效果，胃癌、肝癌内发挥癌基因作用〔13，14〕。本研究结果与刘扬帆等〔15〕、Miao等〔16〕研究结果近似。此外，本研究结果提示miR-362-3p在LC中发挥潜在癌基因作用。临床证实，miRNA通过降解或抑制靶基因mRNA生物活性发挥生物学功能〔17〕。miR-362-3p靶向作用于CD82刺激胃癌组织细胞向皮间质转化〔18〕；肾细胞癌中miR-362-3p表达降低，并靶向Nemo样激酶抗体抑制恶性细胞侵袭活性，在其他类型疾病中miR-362-3p能通过抑制含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-1活性阻断血管平滑肌细胞迁移，且可靶向Pax3阻滞滋养层细胞增殖、迁移、侵袭〔19〕。但miR-362-3p具体通过哪种靶基因刺激LC细胞迁移、侵袭，本研究未进行探究，需后续研究进一步证实。

SCCAg、CYFRA21-1、CA199、CEA、TK1均是临床常用肿瘤恶性程度评估血清学指标，且多种肿瘤标志物联合检测敏感性、特异性理想。本研究结果与沈敏等〔20〕研究结果一致。提示LC组织miR-362-3p、miR-217表达与恶性程度关系密切，临床检测其表达状态可有效评估病变情况。

综上，老年患者LC组织中miR-362-3p、miR-217表达异常，且与恶性程度关系密切，其异常表达是LC发病发展独立危险因素，临床检测LC组织中miR-362-3p、miR-217表达对诊断及评估恶性程度具有重要意义。