miR-21和VEGF在结肠癌中的表达变化及临床意义

刘艳红 陈文霞 屈重行 李琨琨 姜媛媛 吴慧丽

(郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南 郑州 450007)

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率逐年上升，由于肿瘤具有高度侵袭性及转移性导致治疗效果降低及患者预后不良，因而早期诊断及治疗有助于改善患者预后〔1～3〕。微小RNA(miRNA)在肿瘤中异常表达并可能参与癌症发生及发展过程，研究表明微小RNA-21(miR-21)在乳腺癌中呈高表达，并可能作为乳腺癌诊断及判断预后的重要标志物〔4〕。但miR-21在结肠癌发生及发展过程中的作用机制尚未完全阐明。血管内皮生长因子(VEGF)在结肠癌中呈高表达并可参与结肠癌发生及发展过程〔5〕。研究表明miR-21可能通过调控VEGF表达从而参与胶质瘤发生及发展〔6〕。但miR-21是否可通过调控VEGF表达从而参与结肠癌发生及发展尚未可知。本研究主要探讨miR-21、VEGF在结肠癌中的表达并探究其可能临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年5月至2017年2月郑州大学附属郑州中心医院收治的80例结肠癌患者，年龄45～78岁，平均(63.64±12.03)岁，男43例，女37例，所有患者经病理证实为结肠癌，51例发生淋巴结转移，29例未发生淋巴结转移；中高分化32例，低分化48例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期患者30例，Ⅲ～Ⅳ期50例。根据miR-21、VEGF表达量的平均值将结肠癌患者分为miR-21高表达组(55例)、miR-21低表达组(25例)、VEGF高表达组(50例)、VEGF低表达组(30例)。 纳入标准：术前未接受放化疗治疗；肿瘤分期符合国际抗癌联盟标准。排除标准：合并其他恶性肿瘤；肝、肾等重要器官严重受损；生存期不超过3个月。术中切除结肠癌组织及其相应癌旁组织，液氮中保存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.2主要试剂 miR-21、VEGF mRNA引物由广州Invitrogen公司合成；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录与实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3实时荧光定(qRT)-PCR检测miR-21、VEGF mRNA的表达水平 采用Trizol法提取结肠癌组织及癌旁组织中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。参照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA。miR-21正向引物5′-ATGGGCTGTCTGACAAGCTA-3′，反向引物5′-TCTCGCATAGTACGCTAGCT-3′；VEGF正向引物5′-TCTACCTCCACCATGCCAAG-3′，反向引物5′-CACAGGACG GCTTGAAGATG-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACA GAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应体系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环40次。miR-21以U6为内参，VEGF以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-21、VEGF mRNA相对表达量。

1.4随访 患者均进行3年随访，随访方式为电话或复查，统计患者生存时间及生存率。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析、χ2检验；Pearson法、Kaplan-Meier、Log-Rank法、COX比例风险回归。

2 结 果

2.1结肠癌组织中miR-21、VEGF mRNA表达量比较 与癌旁组织比较，结肠癌组织中miR-21、VEGF mRNA表达量显著升高(P<0.001)，见表1。

表1 结肠癌组织中miR-21、VEGF mRNA的表达量比较

2.2miR-21、VEGF表达量与结肠癌患者临床病理参数的相关性 miR-21、VEGF与TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关(P<0.05)，见表2。

表2 miR-21、VEGF表达量与结肠癌患者临床病理参数的相关性〔n(%)〕

2.3结肠癌患者miR-21、VEGF表达量的相关性 miR-21与VEGF呈正相关(r=0.619，P=0.000)。

2.4miR-21、VEGF表达量与结肠癌患者预后的相关性 miR-21低表达组生存率为52.32%，miR-21高表达组生存率为22.10%；VEGF高表达组生存率为18.35%，VEGF低表达组生存率为42.10%，miR-21低表达组与miR-21高表达组生存率差异有统计学意义(P<0.05)，VEGF高表达组与VEGF低表达组生存率差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 miR-21、VEGF表达量与结肠癌患者预后的相关性

2.5影响结肠癌患者预后的多因素分析 淋巴结转移、分化程度、miR-21、VEGF是影响结肠癌患者预后的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响结肠癌患者预后的多因素分析

3 讨 论

miRNA在肿瘤发生及发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用，既往研究显示miRNA可通过调控下游靶基因表达从而参与结肠癌发生及发展过程〔7～9〕。但仍有部分miRNA在结肠癌发生过程中的作用机制尚未阐明。

miR-21下调可抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭并可抑制细胞凋亡〔10〕。研究表明miR-21在肺癌患者中表达上调并可能作为肺癌早期诊断的生物学指标〔11〕。miR-21在肝癌组织中呈高表达，其高表达量与患者恶性临床病理特征密切相关〔12〕。miR-21在大肠癌中呈高表达并可参与肿瘤发生及发展过程〔13〕。本研究结果说明随着结肠癌患者TNM分期的增加、淋巴结转移及分化程度的增加miR-21的表达量显著升高。提示miR-21高表达量可参与结肠癌发生及发展过程，并在结肠癌发生过程中发挥重要调控作用。

VEGF在结肠癌组织中呈高表达，其表达量与患者临床病理特征密切相关〔14，15〕。研究表明VEGF在肺癌中呈高表达，其高表达量与肺癌疾病严重程度密切相关，并可能作为肺癌诊断的有效指标〔16，17〕。本研究结果提示VEGF在结肠癌中高表达并可能参与结肠癌发生及发展过程。提示miR-21可能通过促进VEGF表达从而参与结肠癌发生及发展过程。同时本研究结果提示miR-21、VEGF表达量升高预示结肠癌患者预后不良，miR-21、VEGF表达量升高可能增加结肠癌的发生风险并可能作为判断患者预后的重要指标。

综上，miR-21、VEGF在结肠癌中呈高表达，二者呈正相关且与患者临床病理参数密切相关，并可能作为结肠癌诊断及判断患者预后的重要生物标志物。但关于miR-21、VEGF在结肠癌发生及发展过程中的具体作用机制仍需体内实验与体外细胞实验进行验证。