脆木耳基因组DNA提取方法优化*

王艺琴，郭 豪，张素勤，耿广东

（贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025）

木耳（Auricularia spp.）属担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科（Auriculariaceae），是一类重要的木腐菌，为森林生态系统中的降解还原发挥重要作用[1]。木耳属真菌具有较高的营养、药用和经济价值，是世界上栽培最多的食用菌种类之一，具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂、降胆固醇等作用[2-6]。木耳子实体富含大量多糖、蛋白质和胶质物，严重干扰了其基因组DNA（gDNA）的提取。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法和十二烷基硫酸钠（SDS） 法作为DNA提取的常用方法，常需根据生物特性的不同进行改进。由于多糖可储存营养且是组成细胞结构的重要物质，是在分离许多植物物种的DNA时最常遇到的问题之一[7]，已经成为植物DNA提取过程中的主要干扰成分[8]。多糖与DNA的理化性质很相似[9]，在操作过程中会与DNA相互结合形成粘稠胶状物，从而难以提取DNA。有些酶还可能会因活性中心或必需基团被这种多糖胶状物所改变而遭到活性抑制，严重影响后期分子生物学方面的研究工作。

已有研究表明，不同的DNA提取方法适用的真菌种类差异较大[10]。杨华和李联泰[11]对食用菌菌丝DNA提取方法进行了优化，但由于木耳子实体及菌丝中含有大量的多糖，采用常规CTAB法、SDS法提取gDNA时，提取出的DNA带有棕褐色胶冻状多糖物质，经琼脂糖电泳检测后发现DNA拖尾、加样孔明亮，且有严重的蛋白、多糖和多酚污染，后续试验难以开展。已有研究报道，真菌的gDNA提取试剂盒虽可有效提取真菌gDNA，但DNA产率低，且存在明显降解问题，不能满足后续试验需求[11]。

因此，通过采用4种方法从脆木耳（Auricularia fibrillifera）新鲜子实体中提取gDNA，探索能提取高质量gDNA的方法，为木耳gDNA的提取、种质鉴定、遗传图谱构建、分子辅助育种等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

脆木耳菌株，源自贵州大学园艺科学基础实验室。脆木耳栽培袋制作参考张晓宇等[12]的方法；栽培料配方：木屑78%、麸皮20%、石膏1%、石灰1%。

CTAB 提取液：3%CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、1.5 mol·L-1NaCl。CTAB-free 缓冲液：200 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1EDTA、250 mmol·L-1NaCl，使用前加入 1%的 β-巯基乙醇。

1.2 试验设计

栽培种于贵州大学园艺科学基础实验室的培养室内进行培养，温度（25±1）℃；当子实体直径达到2 cm～3 cm时，选取10个长势一致的子实体，切块后混匀，用于提取DNA。取0.1 g子实体混样，于液氮中用研钵磨成粉末，分别采用改良CTAB法、CTAB-free法、试剂盒法和试剂盒联合CTAB-free法提取gDNA，每种方法设置3次重复。

1.3 脆木耳子实体gDNA提取方法的筛选

1.3.1 改良CTAB法

参考刘丽等[13]提取齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）的改良CTAB法。将子实体混样粉末、65℃预热的1 mL CTAB提取液（CTAB提取液预热后加入1%的β-巯基乙醇） 和60 μL β-巯基乙醇一起置于2 mL离心管中，剧烈振荡至样品与提取混合液充分混合均匀。离心管于65℃水浴45 min，在此期间上下反复颠倒2～3次，重悬，之后加入无水乙醇（0.25倍体积） 和5 mol·L-1醋酸钾（0.11倍体积），混匀后冰浴1 h。放置至室温后，再加入600 μL的混合液A（氯仿和异戊醇的体积比为24∶1），混匀后12 000 r·min-1、4℃离心 10 min。取上清液加入 5 mol·L-1NaCl至终浓度为 0.7 mol·L-1，530 μL CTAB/NaCl（10%CTAB、0.7 mol·L-1NaCl），混合均匀后65℃水浴30 min。待样品冷却至室温后再加入等体积的混合液A，反复颠倒数次直至液体出现分层，静置后小心吸取上层液体于新离心管中，加入等体积的混合液B（苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1），混匀后吸取上清液。在上清液中加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇及10%的3 mol·L-1NaAC或KAC，轻柔颠倒混匀后-20℃条件下沉淀1 h。4℃条件下12 000 r·min-1离心10 min，小心弃去上清液，用70%乙醇漂洗2次沉淀，小心弃去上清液后真空干燥。用100 μL ddH2O或TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

1.3.2 CTAB-free法

CTAB-free法参考王经源等[14]提取高多糖植物DNA的方法。将样品粉末移入2 mL离心管，加入600 μL CTAB-free缓冲液，振荡混合均匀后将离心管置于冰上10 min。4℃条件下8 000 r·min-1离心5 min后，弃去上清液。加入300 μL CTAB提取液（65℃预热），震荡均匀后65℃水浴30 min。再与300 μL氯仿轻颠混合均匀，5 min后5 000 r·min-1离心5 min。重新转移上层水相移至新的2 mL离心管中，混合2倍体积的无水乙醇，颠倒后静置5 min。将乙醇沉淀絮状DNA小心转移至新的1.5 mL离心管中，加入1 mL 70%乙醇，轻柔洗涤沉淀，小心弃去上清液，重复操作一次。沉淀经空气干燥20 min后溶于100 μL TE缓冲液中，-20℃保存备用。

1.3.3 试剂盒法

真菌gDNA提取试剂盒DP2031购自北京百泰克生物技术有限公司。使用试剂盒进行提取，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.3.4 试剂盒联合CTAB-free法

在样品粉末中加入1.2 mL CTAB-free缓冲液，反复振荡混合均匀后冰浴10 min。4℃条件下6 000 r·min-1离心5 min。小心弃去上清液，沉淀使用真菌gDNA提取试剂盒进行提取。

1.4 脆木耳子实体gDNA质量检测

使用生物光度计（Eppendorf）测定样品浓度和吸光度值，并计算OD260/OD280的比值。当OD260/OD280比值为1.70～1.90，说明DNA纯度较好，可用于后续试验；OD260/OD280比值小于1.70，说明样品中有蛋白质和酚类等杂质；OD260/OD280比值大于1.90，说明样品有RNA残留。

使用1%质量浓度的琼脂糖凝胶；取5 μL DNA样品混匀，加入1 μL上样缓冲液，混合后点样；进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，110 V电泳30 min；采用凝胶成像系统观察并拍照。

1.5 PCR验证

根据Jia等[15]对玉木耳（Auricularia cornea） 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）定量引物筛选的结果，选择多聚泛素基因（Polyubiquitin，UBQ） 作为内参基因。使用内参基因UBQ引物，对4种方法提取的DNA进行PCR扩增，引物信息见表1。

表1 内参基因UBQ引物Tab.1 The primers of reference gene UBQ

PCR的反应体系为20 μL，包含：25 ng DNA，2.4 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），2.0 μL Taq酶缓冲液（10 ×Taq Buffer），0.2 μL Taq 酶 （500 U），ddH2O补足至20 μL。PCR扩增条件为：94℃初始变性5 min；94℃变性 30 s，60℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，35次循环；72℃延伸10 min。

1.6 数据处理与分析

用Excel 2010和SPSS 24.0软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 提取的gDNA浓度及纯度分析

4种方法提取脆木耳子实体gDNA的浓度及含量分析结果见表2。

表2 样品DNA提取浓度及纯度统计Tab.2 Statistical table of DNA extraction concentration and purity of samples

由表2可知，改良CTAB法、CTAB-free法、试剂盒法、试剂盒联合CTAB-free法均能提取出脆木耳子实体中的gDNA。试剂盒联合CTAB-free法提取的gDNA吸光度OD260/OD280比值在1.7～1.9，DNA质量好，且无蛋白和RNA残留，纯度最高。试剂盒法也可提取出较高浓度的gDNA，但OD260/OD280比值大于2.0，纯度较低。CTAB-free法提取的gDNA浓度和纯度均较低，且有明显的蛋白污染。改良CTAB法提取过程中，出现了大量的粘稠胶状物而非澄清的上清液，且抽提后仍有色素残留；提取的DNA浓度最低，且OD260/OD280比值在1.3～1.5，DNA纯度最低。

对采用4种方法提取的木耳子实体gDNA的结果进行方差分析，结果见表3。

表3 不同方法提取木耳子实体gDNA的方差分析Tab.3 Analysis of variance of gDNA extracted from Auricularia fibrillifera fruit body by different methods

由表3可知，不同方法对脆木耳子实体gDNA的提取结果达到了极显著差异（P＜0.01）。因此，试剂盒联合CTAB-free法提取的DNA质量好，纯度高，是脆木耳子实体gDNA提取的理想方法。

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

对4种方法提取的木耳子实体gDNA进行凝胶电泳检测，结果见图1。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection

如图1所示，试剂盒联合CTAB-free法提取的DNA电泳条带明亮，主带清晰且无拖带现象，点样孔干净，证明该方法提取的DNA浓度较高、质量较好，能够有效去除RNA、蛋白质、多糖和酚类等杂质残留。试剂盒法提取的DNA电泳条带比试剂盒联合CTAB-free法提取的DNA条带亮度低，主带明显但有拖尾现象，质量较差。CTAB-free法提取的DNA条带拖尾严重，加样孔有亮带，表明提取的DNA中还含有大量的多糖。试剂盒提取的DNA条带较为清晰，但较CTAB-free法提取的DNA浓度低，所以电泳结果条带较暗。采用CTAB-free处理过的样品再用真菌通用DNA提取试剂盒提取后，经琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带清晰，其提取率和纯度均更高，无拖带现象和RNA等杂质污染。

2.3 PCR验证结果

使用UBQ引物对4种提取方法提取的gDNA进行PCR扩增，目标条带124 bp，结果见图2。

图2 UBQ引物扩增结果Fig.2 Amplification results of UBQ primers

如图2所示，改良CTAB法和CTAB-free法提取的gDNA未扩增出目的条带，改良CTAB法提取的gDNA还存在非特异性扩增条带。试剂盒联合CTAB-free法提取的gDNA扩增出清晰条带，说明该方法提取的gDNA可以适用于后续分子研究。

3 讨论

在提取gDNA过程中，DNA提取的质量受到多个因素影响。很难通过传统的CTAB法或单一的处理从多糖含量较高的组织中提取出高质量的gDNA，大量的粘稠性多糖会包裹DNA共沉淀共溶解，从而影响DNA和其他蛋白质等杂质的分离，严重影响后续试验。因此，有效去除多糖、减少DNA的损失已是提取DNA的关键。由于多糖不溶于乙醇，所以当乙醇溶液加入含有多糖的提取液中时，多糖分子就会被分离；再利用高盐高浓度乙醇溶解多糖、沉淀DNA，则可得到质量较高的DNA[16]。潘英文等[17]利用改良CTAB法和试剂盒法提取富含多糖、多酚物质的兰科植物，得出CTAB法获得的DNA浓度高于试剂盒法，且后续PCR扩增效果也优于试剂盒法。刘丽等[13]使用高浓度的醋酸钾和无水乙醇初步沉淀多糖，再用CTAB/NaCl溶液再次去除多糖，提取出浓度、纯度都较高的齐整小核菌gDNA。张景荣等[18]利用硅胶膜离心柱与自配的溶液提取了高质量的黄秋葵DNA，并发现试剂盒联合CTAB-free法可提取芦荟、石斛、葡萄、无花果等多种富含多糖、多酚以及其他大量次生代谢物的植物gDNA。王志会等[19]使用天根生化科技（北京）有限公司的gDNA提取试剂盒提取了酱香型白酒中13个细菌菌株的DNA。CTAB法、试剂盒法及氯化苄法被报道为丝状真菌gDNA的主要提取方法[20]。丝状真菌含有细胞壁，破碎细胞壁后可增加丝状真菌gDNA的提取效率，目前石英砂研磨法和液氮研磨法是破碎真菌细胞壁的主流方法。一种黑曲霉属丝状真菌菌丝富含大量多糖、多酚及色素等，菌丝经液氮研磨后，采用CTAB法提取并结合试剂盒纯化可以有效提取黑曲霉（Aspergillus niger）gDNA[21]。谯利军等[22]利用真菌 gDNA提取试剂盒从红菇子实体中提取出了DNA。

在前人对木耳属真菌的研究中，多数以菌丝体或干样为材料提取DNA，从子实体中提取DNA的报道较为少见[23-28]。木耳子实体和菌丝体中多糖、酚类及色素含量较多，在提取DNA时，这些物质形成的粘稠胶状物会裹挟DNA而导致DNA损失，且这种带有杂质的DNA又会严重影响后续PCR扩增的效果和稳定性。通过在使用试剂盒提取前加入CTAB-free缓冲液，可以去除大部分的粘稠胶状物，大大减少木耳子实体和菌丝体中的多糖、酚类等物质，可明显提高DNA的纯度和质量。