哮喘平冲剂对哮喘大鼠肺组织miR-155表达的影响*

唐阿飞，杨莉，张芮，霍正星，周涛

安徽中医药大学 安徽合肥 230012

支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘，asthma）是一种常见的呼吸系统疾病，由一种或者多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病[1]。目前，哮喘发病率在全球呈上升趋势，在不同年龄，不同人群中均受到影响。哮喘的发病机制目前仍没有得到明确阐释，近些年认为遗传和环境因素共同作用的结果。近年来发现的一类长度为18～22nt的非编码小分子RNA（ribonucleic acid，miRNA），能够特异性地降解靶标基因mRNA或抑制其翻译[2]。哮喘平冲剂是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，在临床使用过程中效果显著。前期动物实验表明，哮喘平冲剂在改善大鼠肺功能、气道炎症和气道重塑方面有着重要的作用[3-4]。本实验通过探讨哮喘平冲剂对于哮喘大鼠肺组织miR-155表达的影响，进一步明确哮喘的发病机制，为临床提供新的诊疗思路。

资料与方法

1 动物与分组

将60只健康雄性SD大鼠，以每组10只，分为正常对照组（A）、哮喘模型组（B）、桂龙咳喘宁组（C）、哮喘平冲剂高剂量组（D）、哮喘平冲剂中剂量组（E）、哮喘平冲剂低剂量组（F）。动物常规饲养于室温（25±1）℃环境中，适应7天后进行实验。

2 观察指标

2.1 药物 哮喘平冲剂（蛤蚧8g，麻黄6g，山药20g，白术10g，木蝴蝶10g，紫苏子10g，川芎10g）由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供。桂龙咳喘宁颗粒剂：桂龙药业（山西）有限公司生产，批号：Z20172117。

2.2 试剂与仪器 卵清蛋白（OVA，美国 Sigma 公司，批号：A5253）；氢氧化铝：上海东山化工厂；普通PCR仪，杭州晶格科学仪器有限公司，型号：K960；荧光定量PCR仪，Thermo PIKOREAL 96。

2.3 模型制备与给药方法 A组以生理盐水致敏和引喘，其余各组腹腔注射10%卵蛋白（OVA）0.5mL致敏，制备CVA模型。于第22天开始用雾化吸入器喷雾1%卵白蛋白（5mL）诱喘20min，1次/d，连续2周，以大鼠出现烦躁不安、打喷嚏、喘鸣、抓耳朵等症状为激发成功。哮喘平各剂量组、桂龙咳喘宁组开始给予相关药物灌胃治疗，空白对照组和模型对照组予以生理盐水灌胃，连续给药21d。连续灌胃8d。灌胃给药与雾化激发同步进行。

2.4 取材 加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃ 12000rpm离心15min，取上清（约500ul）加入到另一EP管中。加入0.5mL异丙醇，温和混匀，室温放置1min。4℃12000rpm 离心10min，弃去上清。加入1mL75℅乙醇（DEPC水配制）。4℃12000rpm离心5min，弃上清。室温放置30min干燥RNA沉淀。加入20-50 μL DEPC水， 55℃促溶10min，-80℃保存备用

2.5 荧光定量PCR检测miR-155的表达 取100mg肺组织，加入1mlTRIzol，提取肺组织总RNA。RNA取反应液200ng作为荧光定量的模板，在10μL反应体系中，加入2×one-step qPCR mix 10μL，Forward primer （10uM）、Reverse primer（10uM）和RT primer（10uM）各0.4μL。反 应 条 件 如 下：95℃10min、95℃10sec、60℃60sec，40个循环。数据采用仪器自带软件relative quantification study方法分析，mRNA相对表达量=2-△△Ctx100%。

3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行处理，结果用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD法，当P＜0.05时，认为差异具有统计学意义。

结 果

1 气道病理形态学观察

正常对照组肺组织无炎性细胞浸润，气道上皮细胞完整，气道壁未见明显增厚；哮喘模型组肺组织有炎性细胞浸润，气道上皮细胞不全，管壁狭窄，哮喘平高剂量组和桂龙咳喘宁组较模型组明显改善，其它组肺组织形态学改变介于哮喘平冲剂高剂量组与模型组之间。见图1。

图1 各组大鼠肺组织形态学比较（HE染色，×400倍）

2 哮喘平冲剂对哮喘大鼠miR-155表达水平的影响

哮喘模型组肺组织中miR-155表达显著低于正常对照组（P＜0.01）；与哮喘模型组比较，桂龙咳喘宁组、高剂量组、中剂量组、低剂量组肺组织中miR-155表达显著升高（P＜0.01或P＜0.05），见表1，图2。

图2 哮喘平冲剂对哮喘模型大鼠miR155表达水平的影响（±s， n=10）

表1 哮喘平冲剂对哮喘大鼠miR155表达水平的影响（ ±s， n=10）

表1 哮喘平冲剂对哮喘大鼠miR155表达水平的影响（ ±s， n=10）

注：与正常对照组比较*P＜0.05；与哮喘模型组比较#P＜0.05。

组别 例数 miR155正常对照组 10 1.00±0.14哮喘模型组 10 0.08±0.01*哮喘平高剂量组 10 0.54±0.06#哮喘平中剂量组 10 0.43±0.05#哮喘平低剂量组 10 0.11±0.00#桂龙咳喘宁组 10 0.17±0.02#

讨 论

目前认为哮喘是由一种因素导致的慢性气道炎症性疾病。其主要的病理特点为气道炎症和气道重塑。哮喘的发病机制不完全清楚，但近年来研究发现，基于离子通道和信号通路干预气道重塑进程在哮喘发病机制中起重要作用[5-6]。吸入型糖皮质激素是目前首选的控制气道炎症、改善气道阻塞的药物， 早期应用可有效地改善肺功能和气道阻塞， 但激素对肺功能和气道阻塞的改善作用并不能代表其能够抑制气道重塑[7-8]。中医学认为哮喘的病因病机在于先天禀赋不足和外感六淫之邪侵袭所致[9-11]。中医药在治疗哮喘有着独特优势。闫云霞[12]在治疗哮喘方面运用柴胡渗湿汤，发现柴胡渗湿汤通过抑制TGF-β1的表达来改善哮喘气道炎症和气道重塑。宣桂琪[13]通过气阴双补方发现中药复方能够减轻气道平滑肌，降低肺组织中TGF-β1mRNA。张念志教授基于哮病“虚-瘀-痰”理论，运用益气活血化痰之法拟方哮喘平冲剂治疗支气管哮喘，临床应用二十余年床效果 颇佳[14]。

该方中山药益肺养阴，补肾健脾，蛤蚧补肺益肾，纳气定喘，助阳益精，两者联用为君药。白术健脾益气，利水渗湿为臣药辅之。麻黄发汗解表，宣肺平喘，木蝴蝶可清肺热，利咽喉、紫苏子降肺气，化痰涎，三者共用佐药宣肺利肺，止咳平喘，全方结构严谨，切中病机，标本兼顾，共奏益气、活血、化痰、止咳之效。

项目组既往研究表明，哮喘平冲剂能明显改善哮喘症状和肺功能[15]，通过调节嗜酸性粒细胞（EOS）和嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP），抑制TNF-α、IL-4、IL-17的表达而减轻哮喘的高反应性和气道炎症[4，16]。另外，哮喘平冲剂能够通过抑制Bcl-2和促进Bax二者之间的表达水平和调节MMP-9/TIMP-1的平衡，减轻哮喘气道重塑，改善哮喘症状[4，17，18]。为进一步探究哮喘平冲剂干预哮喘的分子机制，项目组首次以miRNA作为评价指标，或许为阐明哮喘的发病机制提供新的思路。

miRNA是一种长度为18～22个nt，具有高度特异性的单链小分子非编码RNA，广泛参与细胞的生长，发育，繁殖，对于免疫系统也有着重要作用[19-20]。近些年认为miRNA可能在哮喘的发病中起到重要作用。Lu[21]等认为，miR-21在调节哮喘Thl/Th2机制中有着重要的作用。Dragon[22]等发现在哮喘患者肺组织中高表达的miR-26a、miR-200c、let-7b、miR-16和miR-125b，可能是参与调控气道及肺组织相关基因表达的miRNA。miR-133、miR-25、miR-146a和miR-26a的机制是通过改变炎性因子（如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）的表达[23]。在哮喘发生发展过程中miR155能够影响炎性因子的表达（IL-35，IL-6），也能够调控IL-13的通路，调节T细胞向T1分化[2]。因此推测miR-155在哮喘发病过程中有着重要的作用[24-25]。miR-155的表达水平降低可导致哮喘炎症细胞因子表达增多，气道重塑加重[26]。也有学者指出来RNA的异常表达可能会增加哮喘的严重度[27]。

本研究中哮喘模型组大鼠miR-155的相对表达量较正常对照组明显减少（P＜0.01），说明造模成功。其中，哮喘平高、中剂量组与桂龙咳喘宁组相比，可显著升高大鼠miR-155相对表达量（P＜0.01），说明哮喘平高、中剂量效果优于上市中药制剂桂龙咳喘宁，提示哮喘平冲剂高、中剂量可有效增强miR-155的相对表达量，减轻炎症反应和哮喘症状。

综上所述，哮喘平冲剂能直接或间接上调miR-155的相对表达量，提高机体的保护机制，最终达到缓解气道炎症和阻止气道重塑进程的效果，这可能为临床治疗哮喘提供了新思路。