金线莲苷对二乙基亚硝胺致小鼠肝损伤的保护作用及PELP1/ERK通路的影响 *

孙燕玲，周荟慧，张 池，汤秘密，陈 攀，石浩楠，徐欣瑶，王子澳，司马学琴，吕建国**

(1.湖北科技学院医学部基础医学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室；3.湖北科技学院医学部国家级全科医学实验教学示范中心)

肝脏是人体最重要的器官之一，承担机体多种生理功能，因此，其良好的生理状态是维持身体健康的重要保证。肝脏容易受到各种外界因素的影响，过强或长期的刺激可导致肝损伤，引发多种肝脏疾病，从而严重威胁人类健康[1]。中药在治疗肝损伤方面有其自身的特点和优势，其可在一定程度上修复肝损伤并促进肝脏组织再生。金线莲苷(kinsenoside,KS)是从开唇兰属植物金线莲中提取的有效活性成分，已有报道证实[2]，其不仅可以治疗骨质疏松、高血压、高血脂等疾病，对肝脏也有一定的保护作用。谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutamic acid-,and leucine-rich protein 1,PELP1)是一种雌激素受体辅助活化因子，在多种组织中广泛表达[3]，细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是一种信号转导蛋白，激活的ERK由胞浆转移到核内，参与细胞的多种生物学反应[4]，PELP1可通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号转导通路，诱导细胞炎症反应，促进组织损伤[5]，但PELP1/ERK通路在肝损伤中的作用尚未有明确阐述。本研究通过腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导C57BL/6小鼠出现肝损伤，探讨金线莲苷对DEN致小鼠肝损伤的保护作用及PELP1/ERK通路的影响，为进一步研究肝损伤的发生发展以及预防和治疗肝损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠，6～8周龄，体质量20～25g，共24只，购自湖北省实验动物研究中心(动物合格证号：42000600033780)。动物自由饮食进水，动物房保持12h昼夜节律，温度设定为22℃～26℃。

1.2 试剂与仪器

金线莲苷、DEN均购自上海源叶生物科技有限公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗PELP1抗体、抗ERK抗体和抗p-ERK抗体购自英国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒均购自美国R&D Systems公司。德国LeicaRM2245石蜡切片机；日本SanyoMDF-U53V-80℃超低温冰箱；德国Sigma3K15高速冷冻离心机；美国Bio-RadPowerPac Basic Western blot电泳仪；美国BiotekEpoch全波长酶标仪；美国Bio-RadCFX Connect荧光定量PCR仪。

1.3 动物分组

动物进行适应性饲养，1周后，24只小鼠随机分组：正常对照组(Control组)、二乙基亚硝胺组(DEN组)、金线莲苷治疗组(KS组)，每组8只。DEN组和KS组一次性腹腔注射20mg/kg DEN，注射体积为10μL/g，正常对照组腹腔注射相等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)；2周后，DEN组和KS组在饮水中添加浓度为10mg/L的DEN，同时KS组小鼠腹腔注射金线莲苷进行治疗，给药剂量为5mg/kg，注射体积为10μL/g，对照组正常饮水。

1.4 肝脏组织病理学检查

4周后断颈法处死小鼠，快速摘取小鼠肝脏，观察肝脏大小、质地、颜色等。切取部分肝组织，置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定，流水冲洗，然后从30%酒精开始进行梯度脱水，常规制成石蜡包埋块后切片，切片厚度为4μm，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.5 血清生化指标检测

眼眶静脉丛采血，静置于室温下，1h后在4℃条件下离心，2 000～3 000rpm，20min，吸取上清，用EP管分装后冻存于-80℃待用。通过可见分光光度法检测各组小鼠血清ALT、AST和ALP的含量，操作步骤按照相关试剂盒说明书进行。

1.6 肝脏PELP1、ERKmRNA水平检测

提取肝脏组织RNA，计算RNA浓度，在42℃，60min条件下进行逆转录反应，95℃，5min条件下进行酶灭活，所得cDNA产物冻存备用。按照实时荧光定量PCR引物设计原则设计小鼠GAPDH、PELP1、ERK引物，引物序列由武汉擎科生物技术有限公司合成(见表1)。以逆转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系总体量为10μL，包括：模板(cDNA)1μL，2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Nuclease-Free Water 3μL。PCR反应条件为：95℃，30s变性；58℃，30s退火；72℃，50s延伸；共39个循环。以GAPDH为内参。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.7 肝脏PELP1、ERK蛋白表达水平检测

提取肝脏组织总蛋白，测定蛋白浓度；加5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水中煮8min使蛋白充分变性；以12%的分离胶和5%的浓缩胶电泳分离蛋白；以湿法转移到NC膜上；5%脱脂奶粉封闭90min；加入兔抗小鼠PELP1(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)，4℃孵育过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室温下摇床孵育60min；洗膜后采用增强化学发光法显色，以β-actin(Abbkine)为内参。

1.8 炎症因子水平检测

用预冷的1×PBS对小鼠肝脏组织进行漂洗并制备成10%(mg/kg)的匀浆液，4℃以10 000g离心10min，吸取上清，分装于EP管后冻存于-80℃待用。使用酶标仪通过酶联免疫吸附法测定肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度，波长450nm处测定吸光度，实验操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝脏组织病理学变化

正常对照组小鼠肝脏表面光滑、颜色暗红、质地软；DEN组小鼠肝脏表面粗糙、颜色变深、质地变硬；KS组小鼠肝脏积增大，并有充血现象，但其病变程度明显轻于DEN组。见图1。

图1 各组小鼠肝脏形态学变化

正常对照组显微镜下可见小鼠肝脏组织内肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列，肝细胞结构完整，细胞核、细胞质均匀分布，中央静脉和门管区结构完整；DEN组小鼠肝脏组织正常结构被破坏，肝细胞排列紊乱，细胞水肿，肝组织点状及灶性坏死，伴有炎性细胞浸润；KS组小鼠肝小叶基本完整，肝小叶中央区域肝细胞胞浆疏松化，部分肝血窦扩张充血，中央静脉和门管区清晰可见，细胞损伤性变化与DEN组相比明显减轻。见图2。

图2 各组小鼠肝脏组织病理学变化

2.2 血清生化指标含量变化

与对照组比较，DEN组小鼠血清ALT、AST和ALP含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；KS治疗4周后可显著降低小鼠血清ALT、AST和ALP的含量，与DEN比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组小鼠血清ALT、AST和ALP的含量(n=8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3 肝脏组织中PELP1、ERK mRNA水平

DEN组小鼠肝脏组织PELP1、ERK mRNA水平与对照组相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；KS治疗4周后小鼠肝脏组织PELP1、ERK mRNA水平与DEN组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 qPCR检测各组小鼠肝脏组织PELP1、ERK mRNA水平(n=8，

2.4 肝脏组织中PELP1、ERK蛋白表达水平

DEN组小鼠肝脏组织PELP1、ERK蛋白表达水平与对照组相比显著升高，KS治疗4周后小鼠肝脏组织PELP1、ERK蛋白表达水平与DEN组相比显著降低。见图5。

图5 Western blot检测各组小鼠肝脏组织PELP1、ERK蛋白表达水平

2.5 肝脏组织中炎症因子水平表达

DEN组与对照组相比小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；KS治疗4周后与DEN组相比，小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 各组小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度(n=8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

3 讨 论

肝脏是以代谢功能为主的一个器官，承担多种生理机能，在消化、合成、代谢、解毒等方面起着重要作用。病毒、化学物质、代谢异常、酒精及环境因素等都容易使肝脏受到损伤，而肝损伤严重影响人们的身体健康和生活质量。较轻的肝损伤表现为机体肝功能异常，长期严重的肝损伤则会引起肝脏纤维化、肝硬化，甚至发展成肝癌[6]。DEN属于N-亚硝基类有机物，是一种能与DNA反应，引起DNA损伤而致癌的遗传毒性化学致癌物，可诱导多种肿瘤如肝癌、肺癌、胃癌的发生。研究发现[7]，DEN诱导肝癌的基因表达与人类肝癌患者的肝癌组织类似，是常用的肝癌诱导剂，通过DEN建立肿瘤模型可产生严重的肝损伤，损伤通常表现为炎性粒细胞浸润，广泛的小叶出血性坏死，肝细胞异常分裂，肝脏纤维化等。ALT、AST和ALP在机体内广泛存在，但多数存在于肝脏，当肝细胞因炎症、中毒等原因出现损伤时，ALT、AST和ALP由肝细胞释放进入血液，血清中ALT、AST和ALP的含量升高，因此ALT、AST和ALP是检测肝损伤的常用指标[8]。本研究结果显示，小鼠腹腔注射DEN后，肝脏表面变粗糙、颜色变深、质地变硬，显微镜下可见肝脏组织正常结构被破坏，肝细胞排列紊乱，细胞水肿，肝组织点状及灶性坏死，伴有炎性细胞浸润，血清ALT、AST和ALP含量明显高于对照组(P<0.05)，表明DEN诱导小鼠肝脏的结构和功能出现损伤。

中药在防治肝损伤方面占有越来越重要的地位，中药来源丰富，性温低毒，有良好的开发前景，有学者通过基础实验研究及临床研究表明某些中药的活性成分单体及其衍生物对肝损伤有较好的疗效[9]。金线莲为兰科开唇兰属植物，民间传说素有“药王”之美称，又称鸟人参、金钱草，金线莲苷是从金线莲中分离提取的丁酸衍生物葡萄糖苷，是金线莲的主要活性成分。研究表明，金线莲苷具有降血糖、降血脂、保肝护肝和改善骨质疏松等作用[2]。本研究结果显示，应用金线莲苷治疗DEN诱导的小鼠肝损伤后，小鼠肝脏体积略增大，有充血现象，肝小叶基本完整，肝小叶中央区域肝细胞胞浆疏松化，周边部分肝血窦扩张出血，中央静脉和门管区清晰可见，肝脏形态及细胞损伤性变化与DEN组相比明显减轻，血清ALT、AST和ALP含量明显降低(P<0.05)，说明金线莲苷对DEN诱导的小鼠肝损伤有明显的保护作用。

PELP1在多种组织中均有表达，是一种雌激素受体辅助活化因子，其同时参与核受体基因组和非基因组信号转导过程[3]。本实验qPCR和Western blot结果表明，DEN组小鼠肝脏组织PELP1mRNA水平以及蛋白表达水平与对照组相比显著升高(P<0.05)；与DEN组比较，KS组小鼠肝脏组织PELP1 mRNA水平以及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，提示金线莲苷对DEN诱导的小鼠肝损伤的保护作用与PELP1有关。Wong等[10]在研究雌激素非基因组信号转导时发现PELP1能增强雌激素受体α(ERα)与Src酪氨酸激酶的结合能力。雌激素的非基因组信号转导途径之一为MAPK/ERK，ERα本身不具有蛋白激酶或磷酸化酶活性，其诱导MAPK/ERK活化依赖于c-Src的酪氨酸激酶活性[11]。Yan等[5]的研究表明，PELP1的作用机制可能与Src-Erk通路有关。ERα和PELP1分别通过与c-Src SH2和SH3结构域结合，打开c-Src自身封闭结构，使其获得完整的酪氨酸激酶活性，从而激活MAPK/ERK信号转导通路。进一步的研究结果显示，DEN组小鼠肝脏组织中的ERKmRNA水平以及蛋白表达水平与对照组相比显著升高(P<0.05)，而KS组小鼠肝脏组织ERKmRNA水平以及蛋白表达水平与DEN组相比显著降低(P<0.05)，表明金线莲苷可能通过下调PELP1表达，阻断ERK通路活化对DEN诱导的肝损伤进行保护。

ERK是MAPK家族中重要成员之一，是被研究最广泛的蛋白激酶。ERK磷酸化后被激活，将细胞外信号传递至细胞核，从而调节细胞的多种功能，包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞形态的维持、细胞骨架的构建等等[4]。ERK通路的激活还可诱导细胞炎症反应的发生，以及炎症因子的产生和分泌[12]。适量的炎症因子可调节免疫，促进细胞增殖，修复损伤，但过量的炎症因子也会导致组织损伤[13]。TNF-α是介导肝损伤重要的炎症因子，它可以通过调节机体的免疫应答导致组织损伤，也可以激活炎症通路诱导细胞凋亡，还可以刺激TNF-α自身和IL-1β和IL-6等炎症因子的大量分泌，加重组织损伤[14]。IL-1β和IL-6是炎症促进因子，可趋化中性粒细胞，加重肝脏组织炎性细胞浸润[15]。IL-1β还可以通过旁路或经典途径使补体激活，促进免疫球蛋白的分泌，加重由免疫应答所导致的组织损伤。IL-6不仅可以激活补体，还可以通过增强细胞毒性T细胞和NK细胞的能力，加重肝脏的病理性损伤和炎症[16]。本研究发现，与对照组比较，DEN组小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均显著升高(P<0.05)；与DEN组比较，KS组小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均显著降低(P<0.05)，表明金线莲苷对DEN诱导的小鼠肝损伤的保护作用可能与抑制炎症反应有关。

本研究表明，金线莲苷可显著下调PELP1，阻断ERK活化，使ERK诱导的肝损伤小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6表达量下降，并明显改善DEN诱导的小鼠肝损伤肝脏组织病理学变化。

综上所述，金线莲苷对DEN诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用，其机制与下调PELP1表达，阻断ERK通路活化，进而抑制炎症反应有关。本研究讨论了PELP1的表达对肝损伤的影响，以及ERK通路和炎症因子在其中的作用，为金线莲苷对肝损伤的保护作用提供了实验依据。