基于GC-MS与网络药理学对毛菊苣籽挥发油抗AD作用机制的研究

雷 毅，叶银松，马晓丽,2，米 娜，康金森,2，杨 建,2

(1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011，2新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830000，3新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，乌鲁木齐830054)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上主要采用联合用药治疗以减轻患者症状，延缓病情发展[1]。所使用胆碱酯酶抑制如：多奈哌齐、石杉碱甲等，这些药物能在一定程度上改善症状，但不能延缓AD 患者的发病进程，同时还伴有恶心、呕吐等不良反应，因此，研发缓解或治疗AD 的药物具有重要的现实意义[2-3]。毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)为菊科菊苣属植物，属于药食两用植物[4]。毛菊苣籽挥发油的主要成分为萜类、黄酮类、苯丙素类等活性成分，具有保肝、降血糖、调节血脂、抗氧化抗炎、抗菌等多种药理作用[5]。目前，毛菊苣已应用于食品、药品行业。本研究采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[6]分析毛菊苣的主要成分，通过分子对接技术对抗AD 的潜在靶点进行快速筛选，以探究毛菊苣籽挥发油抗AD的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器Waters Quattro Micro GC 气相-质谱联用仪(美国Waters公司)；HLD-10002型电子天平(杭州友恒称重设备有限公司)；挥发油提取器；超纯水由Milli-Q纯水器制备。

1.2 试药乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；毛菊苣种子2021年3月购买于新疆和田地区药材市场，经新疆医科大学药学院胡君萍教授鉴定为毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)的成熟干燥种子。

1.3 数据库及软件在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，http://www.omim.org/)；治疗靶点数据库[7](TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；人类基因信息数据库(GeneCards，http://www.genecards.org/)；有机小分子生物活性数据库(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction 数据库(www.swisstargetprediction.ch)；STITCH(http://stitch.embl.de)；ChemMapper 数据库(http://lilab-ecust.cn/chemmapper/index.html)；UniProt 数 据 库 (http://www.uniprot.org/)；STRING 平台(https://string-db.org/)；Venny2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；DAVID6.8生物信息资源网站(https://david.ncifcrf.gov/)；微生信数据可视化在线绘图网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)；网络拓扑数据分析软件Cytoscpae3.8.1。

1.4 挥发油成分的测定

1.4.1 挥发油的提取 按照《中华人民共和国药典》第四部中挥发油的测定方法从毛菊苣籽中提取挥发油[8]。将200 g 菊苣籽放入1 000 mL 圆底烧瓶中，加入700 mL 蒸馏水，浸泡12 h，挥发油提取器支管内加入3 mL 乙酸乙酯和适量蒸馏水，蒸馏提取10 h，记录乙酸乙酯的体积[9]，打开挥发油提取器的旋塞从下方放出乙酸乙酯层，加入适量无水硫酸钠放入冰箱于4 ℃环境下干燥24 h，使用0.22 μm 有机滤膜过滤，再次将其放入冰箱于4 ℃保存备用。

1.4.2 色谱-质谱条件 色谱条件[10]：色谱柱HP-5MS毛细管色谱柱(30.00 mm×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，采用不分流模式进样，进样量1.00 μL，柱流量1.00 mL/min，柱温初始温度50 ℃，以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。质谱条件：电离源为离子轰击源(electron impact, EI)，离子源温度180 ℃，离子化电压70 eV，接口温度:250 ℃，扫描模式:全扫描模式，m/z:45 ～ 500。

1.5 备选化合物潜在靶点的筛选将备选化合物在PubChem数据库搜索到的SMILES代码导入SwissTarget、STITCH、ChemMapper 数据库中进行化合物靶点查找，汇总得到化合物靶点。为了尽可能得到全部疾病靶点，利用 OMIM、TTD、GeneCards 数据库以“Alzheimer's disease”和“AD”为检索词进行疾病相关靶点检索，汇总去重得到疾病靶点。将检索得到的化合物靶点与疾病靶点分别导入在线网站Venny 2.1.0 中绘制维恩图进行对比，重叠部分为两者的交集，筛选出毛菊苣籽挥发油治疗AD 的潜在靶点，并导入Cytoscape 3.7.2 软件构建化合物-疾病靶点网络图。

1.6 蛋白(PPI)互作网络的构建[11]将潜在靶点交集导入STRING 数据库，限定物种为人(Homo sapiens)，分析蛋白之间相互作用关系，可得到靶点蛋白相互作用的PPI网络。

1.7 GO 基因功能与KEGG 通路分析[12]将潜在靶点交集导入DAVID 6.8 数据库进行GO 生物过程(FDR＜ 0.01)与KEGG 通路分析(P＜0.05)，得到其生物过程、细胞组分、分子功能及主要通路等有关的富集项，将得到的富集数据导入微生信网站绘制富集柱状图和气泡图，得到富集分析的可视化结果。

2 结果

2.1 毛菊苣籽挥发油的GC-MS 分析结果经测定分析共得到64 个成分峰，其中3,4,5-三甲基-1,2,4-三唑、1,2-双[（1 E）-丁-1,3-二烯基]环丁烷、10,13-十八碳二烯酸甲酯，含量分别为20.44%、4.74%、3.17%，见图1。根据GC-MS分析得到的结果进行化合物匹配，共获得28个含量＞0.5%的成分，见表1。

图1 毛菊苣籽挥发油的GC-MS总离子图

表1 毛菊苣籽挥发油的主要成分

2.2 毛菊苣籽挥发油抗AD 的网络药理学分析结果将表 1 中的化合物导入 SwissTarget、STITCH、Chem-Mapper 数据库中进行靶点查找，取并集后去除重复值采用UniProt 数据库从其中18 个化合物共得到185个靶点；从相关疾病数据库中检索导出，取并集后去除重复值并用UniProt数据库进行蛋白名称标准化后共得到279个AD 相关靶点。将化合物靶点和疾病靶点导入Venn 分析得到36 个交集靶点，交集即为毛菊苣籽挥发油治疗AD 的潜在靶点,见图2。将36 个交集靶点与对应的12 个化合物导入Cytoscape 3.7.2 软件绘制化合物-疾病靶点网络图，每条边代表潜在活性成分与作用靶点间的相互作用关系，节点越大代表该化合物度值越大，线条越粗代表节点间关联性越强,见图3。

图2 化合物靶点与疾病靶点的韦恩图

图3 化合物-疾病靶点网络图

2.3 构建蛋白(PPI)互作网络将2.1中得到的36个交集靶点导入STRING 数据库，蛋白来源设置为“Homo sapiens”，进行蛋白-蛋白相互作用分析得到靶点间相互作用关系[13]，见图4。将PPI 网络节点信息导入Cytoscape 3.8.1，根据度值结果显示，度值＞1.591(平均数)的靶点有ESR2、ACHE、KDR、MAOA、CHRM3 等，见表2。

图4 蛋白相互作用网络图

表2 蛋白核心靶点信息

2.4 GO 基因功能分析将36 个交集靶点导入DAVID 6.8 数据库进行 GO 生物过程分析(FDR＜ 0.01)，共得到24条富集结果，其中生物过程(BP)10条，细胞组成(CC)8 条，分子功能(MF)6 条，见图5。生物过程主要涉及化学突触传递(Chemical synaptic transmission)、血清素受体信号传导途径(Serotonin receptor signaling pathway)、磷酸脂酰肌醇3-激酶信号的正调控(Positive regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)等，细胞组成主要涉及质膜(Plasma membrane)、质膜的整体成分(Integral component of plasma membrane)、树突(Dendrite)等，分子功能主要涉及药物的结合作用(Drug binding)、酶的结合(Enzyme binding)、G 蛋白偶联的血清素受体活性(G-protein coupled serotonin receptor activity)等。

图5 GO富集分析柱状图

2.5 KEGG 通路分析选用DAVID 6.8 数据库进行KEGG通路分析(P＜0.05)，共得到7条信号通路及涉及的靶点，见图6、表3。通路主要涉及神经活性配体-受体的相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、钙质信号传导通路(Calcium signaling pathway)、血清素能突触(Serotonergic synapse)、PI3K-Akt信号通路 (PI3K-Akt signaling pathway)、cAMP 信 号 通 路(cAMP signaling pathway)、肌动蛋白细胞骨架的调控(Regulation of actin cytoskeleton)、胆碱能突触(Cholinergic synapse)。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

表3 KEGG通路及涉及的靶点

3 讨论

AD 是老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，中医学认为AD 属于“呆病、健忘、虚劳、善忘”等范畴[14]；研究发现对于治疗AD具有多角度、多靶点的优势，因此本研究结合GC-MS 和生信分析技术初步预测了毛菊苣籽挥发油治疗AD 的作用靶点及可能机制[15-17]。

本次研究通过GC-MS 分析确定了36 个AD 的治疗靶点，筛选出毛菊苣籽挥发油防治AD 的15个潜在核心靶点，其中ESR2 和ACHE 与疾病靶点的相关度最高。雌激素受体(ESR2)是激素调节转录和发育关键方面的转录因子，它的核受体（ERβ）参与情感、情绪、行为和认知的调节，这都对AD 产生影响。研究表明，ESR2 基因多态性与AD 晚期发病有关，该基因的变异可能改变疾病易感性。ESR2基因内含子的遗传变异可能导致雌激素的神经保护作用降低，并诱导黑质神经元丢失，最终导致AD。AChE是生物神经传导中的一种关键性酶，广泛分布于尾状核、黑质、海马和小脑等神经组织。乙酰胆碱酯酶抑制剂可通过抑制AChE 活性，减少ACh 水解，增加海马体和大脑皮层区域的乙酰胆碱(ACh)的水平，由此起到改善AD患者的认知功能。

毛菊苣的保肝、降糖、调节血脂、抗菌等功效已被现代药理学研究所证实，但目前对毛菊苣防治AD的研究未见报道，本研究通过对毛菊苣籽挥发油的主要成分和对抗AD 靶点的快速筛选，通过KEGG 通路分析，富集到毛菊苣籽挥发油抗AD 的生物通路分别为神经活性配体-受体相互作用(13 个靶点)、钙质信号传导通路(10 个靶点)、血清素能突触(9 个靶点)、PI3K-Akt 信号通路 (7 个靶点)、cAMP 信号通路(7 个靶点)[18-19]。这些通路均与AD 有密切关系，可以作为今后毛菊苣挥发油防治AD 在深入分子层面研究的实验基础，为毛菊苣药材的广泛开发提供数据支持。