罗丹明荧光探针研究进展*

陈志鹏，盛家荣

(南宁师范大学 化学与材料学院，广西 南宁 530100)

0 引言

化学荧光探针已有100多年历史了。当前，常用于生物体内活性物质检测的方法有：毛细管电泳法[1-2]、质谱法[2-3]、高效液相色谱法等[4]，但这几种方法检测过程复杂，选择性较差，对比这些方法，荧光探针法是将化学信号转化为光信号，从而达到对生物系统进行检测，具有操作简单，灵敏度高、选择性好、易于进行功能化结构修饰，无需借助大型仪器，可以特异性的识别目标分子，实现非破坏性与可视化检测等优点。目前荧光探针发展迅速，被广泛应用于化学、生物、医学、物理等[5]相关研究领域，在药理及毒理分析、食品安全检测、医学诊疗和环境监测等[6-8]平台扮演着重要角色，因此开发性能更具优良的荧光探针成为科研工作者的研究热点。

1 荧光

较早的荧光的定义是指当紫外或可见光照射到某些物质后能够再发射出波长和强度各不相同的光，停止照射光照射后，光线就会马上或逐渐消失，这是一种光致发光的现象。随着科学家不断研究和探索，有关荧光的奥秘会被揭开。当荧光分子吸收一个或者多个光子后，荧光分子的外层电子从基态 S0跃迁到单重激发态(Sn)能级轨道，通过内转换和振动弛豫释放能量的方式，处在高能级的电子回到第一激发单重态(S1)的最低能级，第一单激发态再通过辐射跃迁的方式释放出光子后回到基态(S0)，此时发出的光子称为荧光。目前受到科学家们青睐的荧光团主要有香豆素类、1,8-萘酰亚胺、罗丹明、菁类、氟硼二吡咯(BODIPY)、呫吨类，这些荧光团都有着不同的激发和发射波长，一般都具有摩尔消光系数高、易于修饰、光稳定性好等优点[9]。

2 罗丹明概述

1905年，Noeleting 和 Dziewonsky 两位科学家首次合成了罗丹明。罗丹明是一种以氧杂蒽为母体，不同的3，6位氨基取代的有机荧光染料，具有较深的颜色和很强的荧光。罗丹明类染料的吸收和发射波长随着3,6位不同氨基的取代而变化，例如罗丹明B，6G，110和101(如图1)在乙醇中的最大发射波长分别为568 nm，558 nm，524 nm，588 nm[10-12]。罗丹明染料具有高的荧光量子产率，高的摩尔消光系数和好的水溶性等光物理性质，且具有低的生物毒性，使其广泛运用于生物标记和荧光探针等领域。

图1 经典罗丹明结构式

罗丹明的内酰胺螺环的“开-关”互变的独特结构引起了许多科学家的关注[13]。当罗丹明的内酰胺螺环处于闭环状态时，它的溶液处于无色无荧光的状态，而当它处于开环状态时，会发出强烈荧光并且颜色鲜艳，这种独特的性质给科学家带来新的荧光探针的设计思路。

2.1 罗丹明探针用于检测金属离子

过渡金属离子是自然界中不可缺少的成分，在许多生物体内参与各种必要的生理和代谢过程。一些过渡金属在体内平衡的丧失会导致多种功能障碍或血液相关的疾病产生[14]。例如，Cu2+缺乏可导致生长衰竭和神经退行性疾病，而过高水平的Cu2+在生物过程中可导致严重综合征，包括阿尔茨海默病，威尔逊氏病，和代谢紊乱[15-17]。此外，过量的金属离子会造成环境污染，严重威胁了包括人类在内的植物、微生物和动物的健康，例如汞离子，含汞未经处理的污染物对环境和人体健康具有严重的影响[18-19]。

首次利用罗丹明开环反应检测金属离子的是在1997年，Czarnik的团队[20]报道了一项利用罗丹明B衍生物检测Cu2+的开创性工作，反应机理结构式见图2。该团队利用罗丹明B酰肼能够特异性识别Cu2+而进行开环来进行检测，当探针遇到Cu2+后，Cu2+促进罗丹明B酰肼水解成罗丹明B。该探针在pH为7的条件下可以在2 min内检测到10 nM的Cu2+，此工作被报道后罗丹明的开环反应得到大量的关注。

图2 首例检测铜离子探针结构式

2020年，贵州大学的杨松课题组[21]报道了以罗丹明B为母体与2-氨基咪唑基团结合而成的六元环罗丹明探针probe 1和probe 2用于检测铜离子反应机理结构式见图3。与传统的罗丹明五元环、六元环探针与金属离子络合的方式检测相比，该探针是以铜离子诱导催化水解切断C-C或者C-N耦合的方式来检测铜离子。当探针进入体内后，探针首先被铜离子诱导C-C键裂解开环，而后诱导水解切断C-N键使2-氨基咪唑基团离去，最终裸露出罗丹明B发出强烈荧光，最终达到检测的目的。该方法检测铜离子具有良好的选择性和灵敏度，可达到皮摩尔级别的 LOD(35 pM)和纳摩尔级别的灵敏度(80 nM)，为开发检测金属离子的罗丹明探针提供了新的设计思路。

图3 检测铜离子的罗丹明荧光探针结构式

2019年，山东第一医科大学葛燕青课题组[22]报道了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的汞离子探针。该探针利用罗丹明的内酰胺螺环的“开-关”结构并引入咪唑并[1,2-a]吡啶基团设计开发了IP-Hg探针(图4)。该探针本身由于罗丹明部分处于闭环状态，产生FRET的效果非常低，此时在436nm处发蓝色荧光。但是当IP-Hg探针与汞离子络合后，探针的罗丹明部分络合开环后与咪唑并[1,2-吡啶产生强烈的FRET效果，使得发射波长红移在590 nm发出强烈的红光，而在436 nm处荧光减弱，从而达到比率检测汞离子的效果。该探针同时具有良好的选择性和灵敏度，在入射光为370 nm时，F436/F590的线性可达0.998，表现出优良的线性效果，更值得一提的是它的斯托克斯位移可达220 nm,使得它具有良好的抗干扰性。

图4 检测汞离子的罗丹明探针结构式

2.2 罗丹明探针检测pH

在生物体内每天都发生着各种复杂的反应，体内的pH 值也随之不断变化，pH的变化会与人体疾病的发生有着密切联系，pH 值在体内过高或过低的表达都会对人体造成伤害,甚至引起细胞功能障碍,导致产生癌症、心肺疾病、阿尔茨海默病等严重疾病[23]。由于罗丹明的内酰胺螺环在碱性条件下一般处于闭环状态，没有荧光，而在酸性条件下，处于开环状态，发出强烈荧光，这为科学家们设计pH型响应探针提供了便利。

2017年，中国科学院王鹏飞课题组[24]报道了一款pH响应溶酶体靶向的近红外荧光探针Lyso-hNR，结构式见图5。该探针由对pH有着独特响应的罗丹明衍生物的内酰胺螺环与溶酶体吗啉靶向基团两个部分组成，探针具有良好的溶酶体靶向功能。当探针聚集在生物体内中的溶酶体后，利用溶酶体的酸性环境使得罗丹明衍生物部分开环发出近红外荧光，同时该探针具有非常优异的选择性和灵敏度，并成功运用于生物体内溶酶体成像，从而检测相关疾病的变化。

图5 溶酶体靶向的pH响应型罗丹明探针结构式

经典罗丹明的缺点是斯托克斯位移小，使得罗丹明探针用于生物体内成像的时候因自吸收严重而导致信噪比差，检出限低的情况。基于此2018年，Rudy Luck课题组[25]报道了一种具有大斯托克斯位移的近红外pH响应的罗丹明探针,结构式见图6。传统经典罗丹明利用两个取代氨基作为给电子基团，斯托克斯位移只有15～30 nm，该课题组通过引入一个喹喔啉衍生物来增加一个氨基来作为给电子基团，从而增强它的给电子能力，增大斯托克斯位移，改变其光谱性能，再引入邻苯二胺作为pH响应位点合成探针。该探针的斯托克斯位移达到了67 nm,发射波长红移到650 nm左右，拥有良好的灵敏度和信噪比。

图6 具有大斯托克斯位移探针结构式

2019年，大连理工大学肖义课题组[26]报道了一种基于FRET机理测定炎症巨噬细胞中溶酶体pH值的罗丹明探针，结构式见图7。该探针以对pH响应灵敏度较高的罗丹明B为能量受体，利用可以溶酶体选择的叔胺作为柔性连接基团与对pH不感冒的bodipy 为能量供体相结合，设计开发了BDP-RhB。该探针本身在518 nm处发出绿色荧光，当探针处于酸性条件下，罗丹明B衍生物部分开环与bodipy 形成FRET效果，波长红移，在582 nm处发出强烈红光，而518 nm处荧光减弱，从而达到pH比率检测效果。此前该课题组利用一个刚性连接体设计开发了一款pH响应探针，它的FRET效率达到100%，探针受到pH响应后，bodipy 部分几乎不发荧光了。而此次BDP-RhB 探针利用叔胺这样的一个柔性连接基团，使得FRET效率下降到 95%，在pH响应后依然能够发出微弱荧光，而叔胺在探针的碱性基团作用增强了对溶酶体的选择性，达到了一个对溶酶体示踪的一个效果。

图7 基于FRET 机理pH响应罗丹明探针结构式

2.3 检测生物体内活性氧的罗丹明探针

近年来，活性氧物质的检测一直是科研人员关注的热点，虽然活性氧普遍存在于生物体内，但由于它的量非常低，一般都是微摩尔级别甚至更低，而且活性氧物质活性非常高，因此当它形成后立马就与附近的物质发生反应而消失了，大大增加了检测难度。在生物体内含氧的中间体、中间代谢产物以及含氧自由基和氧的衍生物统称为活性氧，主要包括单线态氧、次氯酸、过氧亚硝根、过氧自由基、超氧负离子、过氧化氢、羟基自由基等，活性氧在生物体内是不可或缺和替代的物质，它的正常表达可以维持机体的稳态和信号的传递，一旦失衡将会导致线粒体、溶酶体和高尔基体等多种细胞器的损伤，进一步导致疾病的发生[27-28]，因此开发检测ROS的罗丹明探针具有重要意义。

2017年，东南大学钱鹰课题组[29]报道一款基于FRET模式检测次氯酸的双光子比率型荧光探针RHSDN,结构式见图8，该探针是将罗丹明-氨基硫脲和吡啶-萘酰亚胺通过苯基间隔连接，探针本身因罗丹明部分处于闭环状态，FRET效果被抑制，探针溶液处于无色绿色荧光的状态，当RHSDN与次氯酸进行脱硫环化反应后，RHSDN的罗丹明内酰胺环被打开与萘酰亚胺形成FRET效应，此时萘酰亚胺作为能量供体，将能量转移至罗丹明，绿色荧光强度降低，波长发生红移，转而发出强烈的红色荧光，此时溶液处于红色，从而达到比率检测次氯酸的效果并且可以用肉眼到颜色变化，非常直观。同时该探针选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强，检出限低至9.6×10-8M。

图8 检测次氯酸机理结构式

目前大多数的荧光探针都会存在一定的ACQ效应，在生物体内生理溶液条件导致荧光减弱甚至猝灭，罗丹明荧光探针也不例外。为了解决这一问题，2018年,唐本忠课题组[30]开发了一款具有AIE效应同时能检测生物体内次氯酸的罗丹明荧光探针TPE-RNS，结构式见图9。该探针是以罗丹明B为母体通过引入四苯基乙烯作为转子来产生AIE效应，进入异硫氰酸苯酯作为次氯酸的识别位点。探针本身在聚集态下只有TPE的蓝色荧光当探针进入生物体内被次氯酸氧化开环后，蓝色荧光迅速减弱，发射波长红移转而发出橙红色荧光，并且该探针不仅可用于活细胞内源性次氯酸的比例成像，而且能够灵敏地区分癌细胞和正常细胞。

图9 具有AIE效应检测次氯酸罗丹明荧光探针结构式

2021年，西北大学杨小峰课题组报道一种以依达拉奉为诱导的检测羟基自由基(·OH)的罗丹明荧光探针RH-EDA(如图10)，依达拉奉是一种目前治疗脑梗塞中风的脑保护剂，也是自由基清除剂，依达拉酮可以与·OH相互作用生成稳定的氧化产物OPB[31]。作者在罗丹明B的母体中引入一个类似于依达拉酮的结构作为·OH识别位点，由于TICT的作用RH-EDA本身是无荧光的，在其进入生物体内后与· OH相互作用生成稳定的产物RH-OPB，同时TICT效果消失，探针发出罗丹明B的强烈荧光，从而达到检测的目的。但由于生物体内存在多种自由基，目前还不能排除其他自由基的影响，基于此还可以开发出更优良的荧光探针。

图10 依达拉酮诱导检测羟基自由基结构式

当前，已有文献报道了大量的检测活性氧物质的罗丹明荧光探针，但是还少有能够同时检测两种活性氧物质的罗丹明荧光探针。2022年，仉华、李平等[32]报道了一种双通道检测过氧亚硝酸盐(ONOO-)和三磷酸腺苷(ATP)的罗丹明探针，结构式见图11。该探针主要由罗丹明B衍生物和1,8-萘酰亚胺两个荧光团组成。

图11 同时检测ATP和ONOO-结构式

通过在1,8-萘酰亚胺上引入一个硼酸酯基团作为ONOO-特异性识别位点，罗丹明B的螺环内酰胺结构作为ATP的识别位点。当探针进入生物体内后，只遇到ATP时，ATP诱导罗丹明B开环，在580 nm左右出发出红色荧光，达到检测ATP的效果；当只遇到ONOO-时，1,8-萘酰亚胺上的硼酸酯被氧化断裂成羟基，此时罗丹明B部分没有荧光，只在562 nm处发出黄色荧光，达到单独检测ONOO-的效果；当两者同时存在时，两个荧光团同时被打开，可以在红色和绿色通道同时检测，达到同时检测ATP和ONOO-的效果。该探针已经运用到生物细胞层面上，在HL-7702 细胞中加入APAP诱导模拟肝毒损伤，此时ATP被消耗和ONOO-水平增高，与正常细胞相比，可以看到在绿色通道荧光明显减弱，在红色通道荧光增强，基于此可利用该探针来观察到疾病的变化趋势。

2.4 罗探明探针用于医学诊疗

在生物体内的生理和病理过程中ROS的浓度是不断变化的，在低水平的时候可以通过激活多种信号通路来调节细胞增殖和分化等重要的生物过程，ROS的过量产生可导致细胞死亡或通过氧化应激过程促进肿瘤的增殖。此外，很多报道表明，与正常细胞相比，一些癌细胞的ROS应激水平显著升高，因此越来越多的科学家利用ROS作为开关去对一些疾病进行诊疗[33-35]。

在癌症诊疗过程中药物一般在运输过程中就被消耗很多，导致到达病变位置的药物少之又少，药效达不到最好，因此开发针对癌症肿瘤的前体药物迫在眉睫。2020年，Avijit Jana 等[36]开发了一种定位于线粒体的基于罗丹明的水溶性良好的光笼，结构式见图12，并且由体外绿光触发的具有特异性、肿瘤细胞选择性的荧光探针，罗丹明B的还原态是没有荧光的而被生物体内的ROS氧化后能够再次发出红色荧光，作者通过引入治疗癌症效果非常的苯丁酸氮芥合成探针HRhod-cbl；HRhod-cbl的诊疗机理是：该探针进入生物体内后，被肿瘤细胞的线粒体中异常高水平的ROS氧化后生成罗丹明的活性光笼，此时探针都聚集在肿瘤细胞的线粒体中，再由体外用绿光激发活性罗丹明光笼，诱导释放出抗癌药物苯丁酸氮芥，该探针实现了对肿瘤细胞的精准打击，大大提高了抗癌药物的药效，为前体药物的开发提供了新思路。

图12 作为药物载体的罗丹明探针结构式

除了抗癌药物难以达到病变组织这一难题，还有如何区分癌变细胞和正常细胞也是一大难题。 为了解决这一难题很多科学家都已经进行相关报道，2021年山西大学郭炜课题组提出了通过一种b-Lap 抗癌药物增大肿瘤细胞的ROS水平，结合能够特异性识别ROS的具有近红外发射的硅罗丹明探针对癌变细胞与正常进行区分的策略[37]。作者将经典的硅罗丹明引入一个吡咯衍生物合成了探针PSiR，结构式见图13。该探针由于吡咯与硅罗丹明母体的PET机制是无荧光的，当与ROS结合后，吡咯上的氮氢被氧化成羟基，抑制了PET效应，发出红色荧光，b-Lap可以导致大量的DNA氧化损伤的肿瘤细胞迅速生成大量的细胞内ROS，此时ROS的水平异常高，因此癌变细胞的荧光要比正常细胞区域要强很多，从而达到区分的效果。

图13 可以区分癌变细胞和正常细胞的硅罗丹明探针结构式

3 结语

罗丹明染料是光谱性能优良的有机染料之一，有着近红外的激发波长与发射波长以及独特的螺环结构作为荧光探针的开关；而荧光探针是检测生物体内各种物质的主要手段之一，具有响应快、选择性好、检测限低等优点， 所以开发不同性能的罗丹明荧光探针有着深远的意义。但是目前罗丹明荧光探针开发还有很多难题，例如常用的罗丹明的斯托克斯位移小,单通道检测、检测物质单一、发射波长短，难以克服荧光的ACQ效应等缺点，这样在检测成像时容易造成强的背景光干扰、分辨率低、清晰度差、组织穿透能力差导致罗丹明探针不能广泛利用于生物成像领域，因此开发性能更为优异的罗丹明荧光探针的还有着巨大前景。