光谱法研究氯喹与人血清蛋白的相互作用*

岑建芳，王慧晓，周志强，杨立云

(南宁师范大学 广西天然高分子化学与物理重点实验室，广西 南宁 530001)

0 引言

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人血清中含量最丰富的载体蛋白质[1]，占人体血浆总蛋白的50%～60%，其在维持渗透压的平衡和转运药物小分子中扮演着重要的角色。当不同结构的药物分子进入人体后，血清蛋白会和这些物质发生相互作用[1-3]，进而影响药物的释放和代谢。因此，研究人血清白蛋白与药物分子的相互作用，对了解药物在人体内的吸收、运输、储存及代谢进程，具有重要意义。

氯喹(Chloroquine,CQ)是一种应用广泛的自噬抑制剂，能抑制溶酶体的活性，进而破坏自噬体与溶酶体的融合，因此对多种癌细胞具有较好的抑制效果。将CQ与化疗、光热治疗等方法相结合，可明显提高抗肿瘤效果。例如，Chen等[4]通过联合紫檀芪和氯喹来治疗胰腺导管腺癌；Xu等[5]设计了一个功能化的二硫化钼纳米片递送阿霉素和氯喹，可有效地杀死Hela-R细胞。最新的研究结果表明CQ有望用于新型冠状病毒的治疗[6]。

通过模拟人体生理环境，采用荧光光谱、圆二色光谱等方法，在分子水平探讨了CQ和HSA的作用机制，获取此过程中的结合常数及结合模式，同时探究了CQ对HSA蛋白结构的影响。研究结果有望为CQ的临床应用提供一定的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LS-55荧光分光光度计(英国Perkin Elmer公司)；QM-8075型高灵敏度稳瞬态荧光光谱仪 (日本HORIBA公司)；圆二色光谱仪(英国Applied Photophysics)；人血清白蛋白(>96%，美国Sigma-aldrich公司)；氯喹(>98%，美国Sigma-aldrich公司)；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱

荧光猝灭光谱：在pH =7.4的PBS溶液中，利用LS-55荧光分光光度计测量不同温度 (298K，304K，310 K)下，CQ与HSA相互作用的荧光光谱。其中，C(HSA)= 2.0×10-6mol/L，C(CQ)= 9.693×10-4mol/L，CQ以3 μL的体积累计加入HSA溶液。激发波长设为280 nm，激发狭缝和发射狭缝分别为：15 nm和10 nm，记录波长范围:280 ～480 nm。

同步荧光光谱：在298 K时，设置仪器激发波长和发射波长的波长差(Δλ)分别为15 nm和60 nm，分别得到酪氨酸残基和色氨酸残基的特征谱图。

1.2.2 荧光寿命

激发波长设为278 nm、发射波长设为350 nm、激发狭缝和发射狭缝分别设为15 nm和10 nm，用QM-8075型高灵敏度稳瞬态荧光光谱仪测量HSA及HSA-CQ体系的荧光寿命。

1.2.3 圆二色光谱

常温下，扫描范围为200～260 nm，响应时间为0.5 s，仪器由Chirascan控制。HSA和CQ的摩尔比为:1∶0,1∶4,1∶10,1∶20,1∶40，平行测定3次。利用SELCON3软件计算HSA中各二级结构的含量。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭机制和结合常数

HSA在350 nm附近呈现较强的荧光发射峰，而CQ几乎不具有内源荧光(曲线I表示)。随着CQ的不断加入，HSA的荧光强度逐渐减小，且最大荧光发射峰出现明显红移，表明CQ能有效猝灭HSA的内源荧光。不同浓度的CQ与HSA相互作用时，HSA的荧光光谱图(T= 298 K,C(HSA)= 2.0×10-6mol/L,C(CQ)/(×10-4mol/L),A～H: 0, 0.06,0.11,0.17,0.23,0.29,0.35,0.41),CQ猝灭HSA的荧光光谱(图1)。

图1 HSA的荧光光谱:曲线I:CQ的荧光光谱图

荧光猝灭类型分为2种：动态猝灭和静态猝灭。对动态猝灭，猝灭剂与荧光体分子之间发生有效碰撞，不会导致蛋白质本身的结构和生理活性发生变化，因此其猝灭常数Ksv随着温度上升而增大；静态猝灭与动态猝灭不同，因其生成了静态复合物，因此猝灭常数Ksv随着温度上升而减小[7，8]。这种猝灭类型不仅在微观方面影响蛋白质的二级构象，且在宏观层面上也会影响蛋白质的生理活性。为了研究CQ猝灭HSA的作用机制，用Stern-Volmer方程处理不同温度下(298、304和310 K)的荧光猝灭数据：

F0/F=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F0为HSA单独存在时的荧光强度；F为加入CQ后HSA的荧光强度。[Q]为CQ的浓度，Ksv为猝灭常数。以F0/F对[Q]作图，拟合得直线，如图2所示，计算Ksv的结果(表1)。显然，随着温度上升，荧光猝灭常数Ksv减小，说明CQ与HSA的作用模式是静态猝灭。

图2 三个不同温度下时的Stern-Volmer关系图

表1 CQ和HSA相互作用的猝灭常数、结合常数以及热力学常数

为了进一步验证CQ与HSA作用是形成复合物的静态猝灭，利用时间分辨荧光光谱法测定CQ作用前后HSA的荧光寿命。动态猝灭会使HSA的荧光寿命改变，而静态猝灭的荧光寿命则基本保持不变[9,10],如图3所示。HSA的荧光寿命是6.03±0.05 ns，HSA-CQ体系的荧光寿命为5.87±0.10 ns。可见，CQ加入HSA前后，HSA的荧光寿命并没有很明显的改变，进一步证明了CQ和HSA之间是有静态复合物生成的静态猝灭。

对静态猝灭，猝灭数据可以用修正的Stern-Volmer方程来进一步处理[11,12],修正方程为：

F0/ΔF=1/(Kafa[Q])+1/fa

(2)

式中： ΔF为CQ作用前后HSA的荧光强度的差值(F0-F)，fa为荧光团可接近猝灭剂的部分，Ka为CQ与HSA相互作用体系中的有效猝灭常数，其值与结合常数接近。以F0/ΔF对1/[Q]作图，如图4所示，所得热力学参数见表1。由表1知，结合常数Ka随着温度的升高而减小，与Ksv随温度的变化趋势一致，说明CQ确实与HSA结合生成静态复合物。

图4 不同温度下修正的Stern-Volmer关系图

2.2 CQ和HSA之间的结合模式

一般情况下，小分子与生物大分子之间主要通过疏水作用力、静电引力、氢键和范德华力等发生相互作用[13]。为了判断CQ与HSA之间的主要作用力类型，可以通过Van’t Hoff方程计算二者之间相互作用过程中的焓变(ΔH)、熵变(ΔS)：

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

式中：Ka为相应温度下的结合常数，R为标准气体常数，T为热力学温度。以lnKa对1/T作图，如图5所示。由斜率可求出焓变(ΔH)，由截距可以求出熵变(ΔS)，反应的吉布斯自由能(ΔG)可由式(4)计算。

图5 CQ与HSA相互作用的Van’t Hoff曲线

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

热力学参数列于表1。可见，CQ与HSA相互作用的吉布斯自由能变ΔG<0，表明CQ与HSA相互作用是自发反应；ΔH<0，说明两者之间的反应为放热反应；ΔH<0、ΔS<0，说明两者之间的结合力主要是氢键和范德华力[14,15]。

2.3 CQ对HSA二级结构的影响

2.3.1 同步荧光光谱

CQ与HSA作用前后的同步荧光光谱图(图6)。当Δλ = 15 nm时，提供酪氨酸残基特征谱图，当Δλ=60 nm时，提供色氨酸残基特征谱图[16]。从图6a可知，随着CQ不断加入，酪氨酸残基的最大荧光发射波长基本保持不变，说明酪氨酸残基周围环境没有变化。而色氨酸残基的最大荧光发射波长发生了明显的红移现象，说明色氨酸残基周围环境的亲水性增大(图6b)[17]。不同浓度的CQ与HSA相互作用时，HSA的同步荧光光谱图(图T= 298 K,C(HSA)= 2.0×10-6mol/L,C(CQ)/ (×10-4mol/L),A～H: 0,0.06,0.11,0.17,0.23,0.29,0.35,0.41)，如图6所示。

图6 不同浓度的CQ与HSA相互作用时，HSA的同步荧光光谱图

2.3.2 圆二色光谱

圆二色光谱可以反映蛋白质的二级结构变化。如图7所示，HSA的CD光谱有两个负的吸收峰，分别在208 nm和222 nm。在208 nm处的吸收峰反映了HSA的α-螺旋结构的特征吸收[18，19]。从图7中可以看出，随着CQ浓度的增加，两个吸收峰的强度都有所降低，且208 nm处的吸收峰降低更为显著。

图7 pH=7.4时的HSA-CQ体系的CD光谱图

为了定量分析HSA二级结构的改变，使用SELCON3解析CD数据，结果列于表2，可以看出α-螺旋含量由原来的62.6%下降到44.6%，说明HSA的α-螺旋结构有所伸展，原因是CQ与蛋白质的多肽链的氨基酸残基结合，破坏了蛋白质的氢键结构，导致肽链变得疏松[20]。

表2 SELCON3 解析得到不同二级结构的分数

3 结论

综合利用荧光光谱、圆二色光谱等方法，探究了CQ和HSA的相互作用。结果表明，CQ能通过静态猝灭的模式有效猝灭HSA的内源荧光，且结合常数Ka随着温度T的上升而减小，与荧光猝灭常数Ksv随温度的变化趋势一致。通过作用过程中的热力学参数，可以得到两者的主要结合力为氢键和范德华力，且为自发反应。同步荧光光谱结果表明，CQ与HSA相互作用后，蛋白质中的酪氨酸残基周围环境不变，色氨酸残基周围环境的亲水性增大。圆二色光谱表明，CQ与HSA的相互作用改变了HSA的二级结构。